转YHem1基因油菜杆株耐盐性及其生理机制的研究

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油菜属十字花科(cruciderae)芸薹属(Brassica)。它是重要的食用油和蛋白质饲料来源,也是我国重要的工业原料之一,在我国人民日常生活以及国民经济建设中有着重要地位。油菜可以种植于内陆平原,也可以种植于山地,更可以种植于沿海滩涂盐碱地,但是,如果种植于盐碱地上,往往会受到土壤盐渍化的影响。如何提高油菜耐盐性,开发利用盐渍后备土地资源,对于提高我国人民生产水平来说有着重要意义。5-氨基乙酰丙酸(ALA)是所有生物体内卟啉化合物生物合成的关键前体,具有提高植物抗盐胁迫的能力。前人开展的相关研究多数是使用外源ALA处理以提高植株耐盐性探讨,迄今未有利用内源ALA过量合成型转基因植株开展油菜耐盐性研究报道。本文以转YHem1基因油菜为材料,比较了与野生型耐盐性差异,并探讨了耐盐机理。现将结果介绍如下。   1.YHem1基因是一个由拟南芥HemA1光敏型启动子控制的酿酒酵母5-氨基乙酰丙酸(ALA)合酶编码基因(Hem1),将其转化植物后可以提高植物内源ALA含量。本研究以转入YHem1基因的油菜植株为材料,研究了不同浓度NaCl处理下对油菜幼苗ALA代谢过程的影响,并分析了相关基因表达的差异。结果表明,转基因植株能够检测出5-氨基乙酰丙酸合酶(ALAS)活性及外源YHem1基因的表达,而且,ALA脱水酶(ALAD)的活性及其编码基因表达在NaCl胁迫下始终高于野生型,说明转入YHem1基因能明显提高植株内源ALA含量,显著增加ALA合成与代谢能力。与野生型相比,转基因油菜叶片在NaCl胁迫下的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素相对含量均明显增加,叶绿素b/a比值提高,表明转YHem1基因油菜通过合成过量的ALA能够促进叶绿素的合成。   2.以转YHem1基因油菜为材料,利用Ciras-2光合仪和植物效率仪(PEA)测定了450mmol·L-1 NaCl胁迫下转基因与野生型油菜叶片光合与叶绿素荧光特性的日变化特征,并分析了Rubisco小亚基编码基因表达量的差异。结果表明,无论是在正常条件下还是盐胁迫下转基因叶片净光合速率(Pn)显著高于野生型。JIP-test分析表明,转基因叶片光合性能指数(PIABS)和PSⅡ最大光化学效率(ψPo)均高于野生型,而K相相对荧光Wk(反映PSⅡ反应中心供体侧放氧复合体活性受抑程度)和受体侧QA被完全还原速率Mo(反映PSⅡ反应中心关闭程度)转基因均低于野生型,尤其在胁迫后更加明显。在正常和盐胁迫条件下转基因叶片Rubisco小亚基编码基因的表达量都明显高于野生型。此外,在不同组织中转基因油菜可溶性糖含量也是高于野生型的。以上结果说明,转基因油菜叶片不仅具有较高的光化学能量转化效率,且具有较高的CO2同化能力,最终积累的碳水化合物也较多,说明转基因油菜具有更强的耐盐能力。   3.以转YHem1基因与野生型油菜植株为材料,研究了不同浓度NaCl溶液处理4d对两种基因型油菜植株叶片保护性酶活性及其相关基因表达的影响,发现随着NaCl浓度的增加,两者超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶活性逐渐升高,而且转基因的始终高于野生型,编码基因的表达量也是前者高于后者。超氧阴离子、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)含量也随着NaCl浓度的升高而升高,但是转基因的超氧阴离子和丙二醛含量都低于野生型,说明转入YHem1基因可以诱导油菜叶片抗氧化酶编码基因过量表达,然后具有更高的抗氧化酶活性,可以减少超氧阴离子积累,防止膜质过氧化,减少盐胁迫伤害,因而,转基因油菜具有更强的耐盐能力。转基因油菜叶片H2O2含量始终保持较高水平,表明它可能作为一种信号分子,参与细胞的生理代谢调控。   4.以转YHem1基因和野生型油菜为材料,研究了在不同浓度NaCl胁迫下两者植株生长量以及组织部位无机离子(K+、Na+、Cl-)和有机物质(脯氨酸、可溶性蛋白、游离氨基酸)含量的变化。结果表明:在相同盐浓度水平下,转基因植株不论地上部、地下部干重还是鲜重都高于野生型,说明转入YHem1基因有利于缓解盐胁迫对油菜植株生长的抑制效应。在不同组织中, K+、Na+含量的变化有所差异,而Cl-含量的变化一致,无论是转基因还是野生型植株,随着NaCl浓度的增加而有上升的趋势,转基因始终低于野生型,由此说明Cl-含量是衡量盐胁迫伤害的重要指标。3种有机物质的变化规律也不同。盐胁迫下,油菜组织脯氨酸变化不明显。这与一般性植物反应完全不同。可溶性蛋白含量随着盐浓度的提高先升高后下降,但是转基因还是高于野生型。游离氨基酸含量随着NaCl浓度的升高而逐渐降低,但转基因植株明显高于野生型,暗示着游离氨酸可能可以作为一个判断油菜耐盐性高低的重要指标。   5.采用珍珠岩基质培养法对盐胁迫下转YHem1基因与野生型油菜幼苗体内各组织矿质元素的分布规律做了研究。结果表明,N、P在茎中含量最多,而S元素在叶片中含量最多;随着NaCl浓度的增加,转基因与野生型N、P和S的变化趋势有所差异,在不同组织变化也不同,N、P在叶片和叶脉中野生型油菜是先升高后降低而转基因有升高的趋势,是野生型高于转基因,除了在450 mmol·L-1时由于野生型油菜叶片已枯死营养成分流失所致,在茎、主根与须根中两者变化与叶片、叶脉趋势一致,但是转基因高于野生型,茎和根分别是储藏和吸收养分的组织,说明转基因油菜储藏和吸收N、P元素的能力高于野生型;在野生型油菜叶片、叶脉、茎S元素的变化趋势是先降低后升高,转基因是逐渐降低的趋势,在叶片和叶脉中野生型在同一盐浓度水平都高于转基因,在茎中两者差异不显著(P>0.05),而主根和须根中两者都有降低趋势;在不同组织中Fe离子的变化趋势不同,含量都是转基因高于野生型;Ca离子含量有逐渐降低的趋势,须根中两者差异显著(P<0.05); Mg离子变化规律不明显;Cu、Zn在不同组织变化趋势都不同,野生型与转基因油菜变化规律也有差异;由此说明盐胁迫对不同基因型的油菜不同矿质元素在不同组织中的变化规律的影响是不同的,其中Fe、Ca离子在不同组织的含量多少或许可以作为耐盐性鉴定指标。
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