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目的:
1、探讨HDAC6基因在食管癌中的表达及临床意义;
2、构建慢病毒载体并制备，该载体携带HDAC6基因并将其靶向沉默，奠定了后续体内、外实验工具的基石，该表达系统的应用，以期验证其进行食管癌基因治疗的有效性;
3、探讨慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制的功能学（食管癌细胞生物学特性）影响，为食管癌临床治疗的新靶向系统最终应用提供实验依据和科学理论。
方法:
1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义
分别采集10例食管癌及癌旁组织，qRT-PCR和Western blot方法检测组织中HDAC6 mRNA及HDAC6蛋白的表达情况。另外选取90例食管癌标本，IHC检测食管癌中组织中HDAC6的表达情况，分析HDAC6的表达与食管癌患者临床病理的关系。
2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备
2.1根据HDAC6基因(NM0001130416.1)序列为标靶，通过BLAST同源性分析，设计、选择两段寡核甘酸序列，长度为21 nt，作为以HDAC6基因为靶点的shRNA片段序列，以该序列为模板，即能合成两对DNA单链片段，并以次为引物，经退火、双酶切后，也同样的把pLKO.1-增强型绿荧光蛋白(enhanced green fluorescenceprotein，EGFP)质粒进行双酶切，连接、转化两种双酶切后的产物，获得2个质粒;以HDAC6基因为模板，合成了2对长引物单链DNA片段，退火后双消化，同一双消化质粒pLKO。1-增强型绿色荧光蛋白（增强型绿色荧光蛋白，EGFP）
2.2 qRT-PCR和Western blot方法检测食管正常上皮细胞系(HEEC-1)及KYSE140、KYSE170和KYSE180三株ESCC细胞系中HDAC6基因的表达情况，将转染稳定的细胞筛出。获得的质粒分别转染ESCC细胞系(KYSE140、KYSE180)，分别用qRT-PCR和Western blot方法检测HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达水平，以HDAC6基因为靶点，筛选出沉默表达效应最显著的质粒;基于该质粒，通过基因克隆技术，可将携带有HDAC6基因靶向沉默的shRNA片段--pLKO.1-shRNA(HDAC6)-EGFP慢病毒包装质粒构建。
2.3采用Invitrogen公司的共转染系统，进行制备慢病毒表达载体系统(Lenti-shRNA(HDAC6)-EGFP)及其相关的质量检测，qRT-PCR和Western blot分别检测转染后KYSE140、KYSE180细胞株中HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达。
3、慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制表达对食管癌细胞生物学特性的影响
3.1靶向HSP90-HDAC6抑制对食管癌细胞生物学特性体外实验
采用构建的Lenti-shRNA(HDAC6)-EGFP慢病毒表达载体系统感染食管癌细胞株KYSE140和KYSE180。
3.2 HSP90-HDAC6抑制剂对裸鼠皮下食管癌细胞移植瘤生长抑制作用的实验研究
建立食管癌细胞KYSE140移植瘤模型，接种2周成瘤后，根据治疗方式的不同，按照随机数字法，将裸鼠分为PU-H71组、Tubastatin A组、PU-H71+Tubastatin A组，并设赋形剂为对照组，进行腹腔注射，观察其对荷瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本、存活情况及下游蛋白表达的影响。
结果:
1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义
1.1 qRT-PCR法检测HDAC6mRNA在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（5.13±3.78）VS（2.12±2.04）。较之于癌旁组织，在ESCC组织中HDAC6 mRNA的相对表达量显著增加，差异明显，组间差异比较具有统计学意义（P＜0.05）。
1.2 Western Blot法检测HDAC6蛋白在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（2.35±1.64）VS（1.21±0.57）。HDAC6蛋白在ESCC组织中的相对表达量较癌旁组织的相对表达量明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
1.3免疫组织化学检测结果显示HDAC6阳性表达位于癌细胞核。90份食管鳞状细胞癌组织标本中，62份HDAC6阳性表达，表达率为68.9％。
KYSE140和KYSE180细胞的增殖能力。在两株细胞中，较之于阴性对照组，干扰靶点1和干扰靶点2组的细胞增殖率均明显降低，差异显著，具有统计学意义(P＜0.05)。
1．4在ESCC患者中，食管癌患者的临床病理分期及淋巴结转移与HDAC6的表达有关(P＜0.05)；而性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、肿瘤分化、肿瘤浸润深度与HDAC6的表达无关(P＜0.05)。
2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备
2.1干扰靶点的设计结果
2.2测序鉴定重组质粒pLKO.1-shRNA(HDAC6)-EGFP
2.3采用共转染策略制备
3、HDAC6siRNA及HDAC6-HSP90i对食管癌细胞生物学特性的影响
3.1HDAC6siRNA及HDAC6-HSP90i对食管癌细胞生物学特性体外实验
3.2 HDAC6-HSP90 i对食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤的影响
结论:
1、HDAC6高表达于食管癌组织中，促进食管癌的发生、发展，有望作为食管癌治疗的重要靶点。
2、采用共转染策略制备，成功的将慢病毒穿梭质粒载体构建后，制备了HDAC6基因靶向沉默表达的Lenti-shRNA(HDAC6)-EGFP重组慢病毒载体，经PCR鉴定和Western blot检测方法，确认构建成功，该慢病毒体系具有可重复性好、高滴度、强感染活性的特点，为进一步开展HDAC6基因的食管癌治疗临床前研究提供了必须的实验工具。
3、HSP90作为HDAC6的底物，其配体的活性部分能够被HDAC6介导的脱乙酰化效应激活。构建的HDAC6基因靶向沉默慢病毒载体通过RNAi在体外可有效抑制食管癌细胞系KYSE140和KYSE180的增殖和细胞迁移运动能力，沉默HDAC6之后，HSP90的脱乙酰化效应随着沉默，表现出HSP90的乙酰化过度，从而导致HSP90配体活性散失，两者联合抑制具有协同作用。联合HDAC6抑制剂(Tubastatin A)和HSP90抑制剂(PU-H71)与单独任一种抑制剂治疗相比显著降低了食管痛细胞系KYSE140和KYSE180的增殖、细胞迁移运动能力及EGFR、p-AKT和p-ERK的蛋白水平。
4、食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤造模成功，HSP90-HDAC6抑制剂显著的抑制肿瘤的生长，有利于改善裸鼠的生存质量，HSP90-HDAC6抑制剂显著降低裸鼠移植瘤中EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平。
5、靶向沉默HDAC6基因可能通过HSP90的过度乙酰化有效阻断食管癌中细胞信号传导通路EGFR、p-AKT及p-ERK表达谱的变化，开辟了阐述食管癌发病机制的全新分子生物学学说，临床应用前景呈现出一片大好的趋势。
1、探讨HDAC6基因在食管癌中的表达及临床意义;
2、构建慢病毒载体并制备，该载体携带HDAC6基因并将其靶向沉默，奠定了后续体内、外实验工具的基石，该表达系统的应用，以期验证其进行食管癌基因治疗的有效性;
3、探讨慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制的功能学（食管癌细胞生物学特性）影响，为食管癌临床治疗的新靶向系统最终应用提供实验依据和科学理论。
方法:
1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义
分别采集10例食管癌及癌旁组织，qRT-PCR和Western blot方法检测组织中HDAC6 mRNA及HDAC6蛋白的表达情况。另外选取90例食管癌标本，IHC检测食管癌中组织中HDAC6的表达情况，分析HDAC6的表达与食管癌患者临床病理的关系。
2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备
2.1根据HDAC6基因(NM0001130416.1)序列为标靶，通过BLAST同源性分析，设计、选择两段寡核甘酸序列，长度为21 nt，作为以HDAC6基因为靶点的shRNA片段序列，以该序列为模板，即能合成两对DNA单链片段，并以次为引物，经退火、双酶切后，也同样的把pLKO.1-增强型绿荧光蛋白(enhanced green fluorescenceprotein，EGFP)质粒进行双酶切，连接、转化两种双酶切后的产物，获得2个质粒;以HDAC6基因为模板，合成了2对长引物单链DNA片段，退火后双消化，同一双消化质粒pLKO。1-增强型绿色荧光蛋白（增强型绿色荧光蛋白，EGFP）
2.2 qRT-PCR和Western blot方法检测食管正常上皮细胞系(HEEC-1)及KYSE140、KYSE170和KYSE180三株ESCC细胞系中HDAC6基因的表达情况，将转染稳定的细胞筛出。获得的质粒分别转染ESCC细胞系(KYSE140、KYSE180)，分别用qRT-PCR和Western blot方法检测HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达水平，以HDAC6基因为靶点，筛选出沉默表达效应最显著的质粒;基于该质粒，通过基因克隆技术，可将携带有HDAC6基因靶向沉默的shRNA片段--pLKO.1-shRNA(HDAC6)-EGFP慢病毒包装质粒构建。
2.3采用Invitrogen公司的共转染系统，进行制备慢病毒表达载体系统(Lenti-shRNA(HDAC6)-EGFP)及其相关的质量检测，qRT-PCR和Western blot分别检测转染后KYSE140、KYSE180细胞株中HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达。
3、慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制表达对食管癌细胞生物学特性的影响
3.1靶向HSP90-HDAC6抑制对食管癌细胞生物学特性体外实验
采用构建的Lenti-shRNA(HDAC6)-EGFP慢病毒表达载体系统感染食管癌细胞株KYSE140和KYSE180。
3.2 HSP90-HDAC6抑制剂对裸鼠皮下食管癌细胞移植瘤生长抑制作用的实验研究
建立食管癌细胞KYSE140移植瘤模型，接种2周成瘤后，根据治疗方式的不同，按照随机数字法，将裸鼠分为PU-H71组、Tubastatin A组、PU-H71+Tubastatin A组，并设赋形剂为对照组，进行腹腔注射，观察其对荷瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本、存活情况及下游蛋白表达的影响。
结果:
1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义
1.1 qRT-PCR法检测HDAC6mRNA在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（5.13±3.78）VS（2.12±2.04）。较之于癌旁组织，在ESCC组织中HDAC6 mRNA的相对表达量显著增加，差异明显，组间差异比较具有统计学意义（P＜0.05）。
1.2 Western Blot法检测HDAC6蛋白在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（2.35±1.64）VS（1.21±0.57）。HDAC6蛋白在ESCC组织中的相对表达量较癌旁组织的相对表达量明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
1.3免疫组织化学检测结果显示HDAC6阳性表达位于癌细胞核。90份食管鳞状细胞癌组织标本中，62份HDAC6阳性表达，表达率为68.9％。
KYSE140和KYSE180细胞的增殖能力。在两株细胞中，较之于阴性对照组，干扰靶点1和干扰靶点2组的细胞增殖率均明显降低，差异显著，具有统计学意义(P＜0.05)。
1．4在ESCC患者中，食管癌患者的临床病理分期及淋巴结转移与HDAC6的表达有关(P＜0.05)；而性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、肿瘤分化、肿瘤浸润深度与HDAC6的表达无关(P＜0.05)。
2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备
2.1干扰靶点的设计结果
2.2测序鉴定重组质粒pLKO.1-shRNA(HDAC6)-EGFP
2.3采用共转染策略制备
3、HDAC6siRNA及HDAC6-HSP90i对食管癌细胞生物学特性的影响
3.1HDAC6siRNA及HDAC6-HSP90i对食管癌细胞生物学特性体外实验
3.2 HDAC6-HSP90 i对食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤的影响
结论:
1、HDAC6高表达于食管癌组织中，促进食管癌的发生、发展，有望作为食管癌治疗的重要靶点。
2、采用共转染策略制备，成功的将慢病毒穿梭质粒载体构建后，制备了HDAC6基因靶向沉默表达的Lenti-shRNA(HDAC6)-EGFP重组慢病毒载体，经PCR鉴定和Western blot检测方法，确认构建成功，该慢病毒体系具有可重复性好、高滴度、强感染活性的特点，为进一步开展HDAC6基因的食管癌治疗临床前研究提供了必须的实验工具。
3、HSP90作为HDAC6的底物，其配体的活性部分能够被HDAC6介导的脱乙酰化效应激活。构建的HDAC6基因靶向沉默慢病毒载体通过RNAi在体外可有效抑制食管癌细胞系KYSE140和KYSE180的增殖和细胞迁移运动能力，沉默HDAC6之后，HSP90的脱乙酰化效应随着沉默，表现出HSP90的乙酰化过度，从而导致HSP90配体活性散失，两者联合抑制具有协同作用。联合HDAC6抑制剂(Tubastatin A)和HSP90抑制剂(PU-H71)与单独任一种抑制剂治疗相比显著降低了食管痛细胞系KYSE140和KYSE180的增殖、细胞迁移运动能力及EGFR、p-AKT和p-ERK的蛋白水平。
4、食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤造模成功，HSP90-HDAC6抑制剂显著的抑制肿瘤的生长，有利于改善裸鼠的生存质量，HSP90-HDAC6抑制剂显著降低裸鼠移植瘤中EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平。
5、靶向沉默HDAC6基因可能通过HSP90的过度乙酰化有效阻断食管癌中细胞信号传导通路EGFR、p-AKT及p-ERK表达谱的变化，开辟了阐述食管癌发病机制的全新分子生物学学说，临床应用前景呈现出一片大好的趋势。