铜是哺乳动物体内必不可少的微量元素之一,具有氧化还原化学性质,对机体的代谢过程有重要的作用。同时,铜作为含铜酶和含铜蛋白质的重要组成部分,参与哺乳动物体内细胞呼吸、自由基清除、色素形成、结缔组织形成、神经肽加工和铁运输等。ATP7A是调节铜稳态的关键蛋白,还参与把铜传递给含铜酶和含铜蛋白,其基因突变导致的疾病,如门克斯病(MD),可以有效证明其作用的重要性。ATP7A功能的障碍往往伴随着神经退行,目前研究显示ATP7A受神经系统发育的时空调控,可能参与神经元的发育。为了研究ATP7A在神经元发育中的调控作用,本试验以C57BL/6小鼠为研究对象,分析了体外培养的小鼠神经干细胞(NSC)、星形胶质细胞和海马神经元中ATP7A的表达水平。并且利用多功能诱导干细胞——小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)向神经元定向分化的方法,研究了MEF敲除Atp7a后向神经元分化的细胞形态学差异,结果如下:1.从C57BL/6小鼠胚胎和新生乳鼠中分别分离出了神经干细胞(NSC)、星形胶质细胞和海马神经元,并通过细胞免疫荧光染色对其进行鉴定,其纯度均达到90%以上。2.分离了E13.5-14.5小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),通过细胞免疫荧光染色分析了MEF和以上三种细胞中ATP7A的细胞定位,显示荧光信号均位于细胞核和质膜之间。3.通过real-time QPCR和Western blot比较了这四种细胞中ATP7A的mRNA及其表达水平,发现ATP7A在MEF、NSC、星形胶质细胞和海马神经元中表达量依次是显著减少的,说明ATP7A的表达随神经发育过程可能下降,并且证明利用MEF向神经元转分化研究ATP7A调控神经元发育的方案是可行的。4.利用分离到的基因型为Atp7afl/Y的胚胎成纤维细胞(MEF7a+),通过感染Cre重组腺病毒敲除Atp7a,获得MEF7a+·Cre+/-,并用real-time QPCR和Western blot验证了其敲除效率约70%。5.进行重组腺病毒Ascl1,Brn2和Ngn2(ABN)诱导MEF7a+和MEF7a+·Cre+/-(ABN+MEF7a+和ABN+MEF7a+·Cre+/-),以及重组腺病毒Cre和ABN共同处理MEF7a+(ABNC+MEF7a+),向神经元的定向分化试验。分化7d和12d后,进行β-Tubulin III免疫荧光染色,对分化出的神经元进行形态上的分析和统计分析,计算胞体面积、神经纤维总长、最长神经纤维长度、从胞体发出的纤维数量、神经纤维分支数量。分化7 d后,实验组与对照组细胞形态无明显差别,阳性细胞胞体呈圆形、椭圆形和三角形,大多从胞体伸出细长突起。统计分析发现分化7 d时,ABN+MEF7a+·Cre+/-胞体体积较其他两组较小(*p<0.05),与对照组相比,其他两组中,细胞从胞体发出较少且较短的神经纤维(***p<0.001,**p<0.01),也具有较少分支(***p<0.001);分化12 d时,ABN+MEF7a+·Cre+/-和ABNC+MEF7a+胞体体积无差别,其他与分化7 d时相似。综上所述,本试验从体外细胞水平证明ATP7A影响体外神经元神经纤维的发育,敲除Atp7a后,细胞突起少且短,分支也较少。本试验为研究ATP7A调节神经元发育的作用提供了重要依据,为研究ATP7A突变引起的神经退行性疾病的机理提供了一定的基础。