同种异基因造血干细胞(Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation,Allo-HSCT)是治疗恶性血液疾病、血液系统遗传性疾病、再生障碍性贫血等疾病的一种有效方法,并获得较好的疗效。但急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-hostdisease,aGVHD)等移植相关并发症是导致患者死亡的重要因素,目前尚无防治aGVHD的有效手段。本实验从骨髓间充质干细胞及可溶性共刺激分子(Inducible costimulator,ICOS)两个方面对GVHD进行干预。第一部分:小鼠骨髓间充质干细胞对急性移植物抗宿主病的预防及治疗作用间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一种来源于中胚层的成体干细胞,具有自我更新及多向分化潜能。它具有易于获得、体外扩增快;体内输注安全,可促进造血干细胞植入、加速造血重建及自身无免疫原性等特点。目前体外实验证实MSC具有免疫调节功能,但是关于其干预aGVHD的报道很少且存在争议。而且目前大多数的体内实验集中于MSC对aGVHD的预防,关于其对aGVHD的治疗作用的报道非常少。针对上述现状,我们设计了如下实验:利用小鼠骨髓间充质干细胞在aGVHD发生的不同时间点,用不同的剂量进行干预,观测其对aGVHD是否具有预防及治疗作用,并阐明其可能发生作用的机制。一:小鼠骨髓间充质干细胞的复苏、扩增和生物学特性的鉴定:方法:复苏本实验保存的P5代小鼠骨髓间充质干细胞,置于mMSCs维持培养基(DMEM-LG+10%FBS)中维持培养。P10代mMSCs,流式细胞仪检测细胞表型表达。定向诱导mMSCs向成脂肪、成骨和成软骨分化,鉴定其多向分化潜能。结果:P10代mMSCs高表达CD29、CD44、Sca-1,中度表达CD13、CD90.2,不表达造血细胞表面标志CD117、CD45,不表达FLK-1、MHC-Ⅱ类抗原。P10代mMSCs可向成骨、成脂肪分化。确定其符合MSC的生物学特性。二:小鼠骨髓间充质干细胞体内对急性移植物抗宿主病的预防及治疗作用:方法:建立以C57BL/6鼠为供体、致死剂量照射的BALB/C鼠为受体的aGVHD动物模型,分成6组(各组n=20):单纯放射组(PBS)、骨髓移植组(BM)、GVHD组、移植0天1×10~5/只mMSCs干预组(MSC-A)、移植0天5×10~5/只mMSCs干预组(MSC-B)、移植+7天1×10~5/只mMSCs干预组(MSC-C)。观测各组的生存率、体重变化、临床aGVHD评分及靶器官损害。结果:PBS、GVHD、MSC-A、MSC-B、MSC-C组的平均生存天数分别为(13.5±2.63)天、(11.1±3.96)天、(26.38±7.70)天、(22.69±9.15)天、(22.92±8.15)天,mMSCs各组与GVHD组比较均有显著性差异(P＜0.01),但mMSCs各组之间无明显差异(P=0.28);GVHD组体重持续下降、而mMSCs各组在移植后第8天达到体重的最低谷,后逐渐恢复至平台期;mMSCs各组的肝脏、结肠、脾脏病理切片显示淋巴细胞浸润及炎症表现明显轻于GVHD组。三、小鼠骨髓间充质干细胞体内对急性移植物抗宿主病干预的机制探讨:方法:在移植后的特定时间点,流式检测各组小鼠的嵌合率、CFSE标记的供体T淋巴细胞的体内增殖、凋亡;ELISA检测小鼠外周血上清细胞因子表达;移植后各组小鼠脾脏来源的T淋巴细胞体外ConA刺激再活化,ELISA测定培养上清细胞因子表达。Ad-EGFP转染mMSCs,输注入GVHD模型小鼠,荧光共聚焦显微镜观察mMSCs在GVHD靶器官组织中的分布。结果:①mMSCs减少Th1类炎症因子的表达。GVHD、MSC-A、MSC-B、MSC-C各组移植后14天外周血上清中IFN-γ的表达分别为:(607.89±157.10)pg/mL、(143.59±37.52)pg/mL、(116.98±77.78)pg/mL、(131.45±63.35)pg/mL,mMSCs各组与GVHD组比较均有明显统计学差异P＜0.05;各组TNF-α的表达分别为:(52.31±17.95)pg/mL、MSC-A组(6.02±3.99)pg/mL、(5.21±0.28)pg/mL、(22.39±18.21)pg/mL,其中MSC-A、MSC-B组与GVHD组比较有明显统计学差异P＜0.05。各组的IL-4、IL-10均低于标准曲线最低值;②mMSCs不影响aGVHD环境中异基因T淋巴的增殖,但缩短其生存时间。移植后第3天流式细胞术检测小鼠外周血CFSE标记的供体T淋巴细胞增殖状态。GVHD、MSC-A、MSC-B各组的CD3~+CFSE~-细胞群的频率分别为:(98.40±1.32)%、(97.69±2.19)%、(97.44±2.31)%,各组之间无统计学差异。移植后第10天流式细胞术检测小鼠脾脏来源的T淋巴细胞的凋亡状态。GVHD、MSC-A、MSC-B、MSC-C各组的CD3~+AnnexinV~+PI~-细胞群的频率分别为:(10.33±6.61)%、(13.51±13.75)%、(19.68±5.98)%、(16.56±7.27)%,其中MSC-B组与GVHD组比较具有统计学差异(P＜0.05);③mMSCs抑制异基因T淋巴细胞的二次活化功能。移植后第14天分离小鼠脾脏来源的T淋巴细胞。体外ConA刺激培养48—72小时后,上清测细胞因子。GVHD、MSC-A、MSC-B、MSC-C各组的IFN-γ浓度分别为(2030.65±876.36)pg/mL、(656.70±328.68)pg/mL、(547.38±278.79)pg/mL、(306.07±143.59)pg/mL;IL-4的浓度分别为(306.33±6.84)pg/mL、(38.82±0.33)pg/mL、(32.64±0.01)pg/mL、(21.82±1.09)pg/mL;IL-10的浓度分别为(456.03±69.61)pg/mL、(449.65±168.61)pg/mL、(319.07±33.37)pg/mL、(239.27±46.43)pg/mL。MSC干预后,供体淋巴细胞体外二次活化功能明显受抑,细胞因子分泌显著下降,以IFN-γ最为明显,提示活化功能减弱。④mMSCs可能参于aGVHD靶器官的修复。Ad-EGFP成功转染mMSCs,12小时转染率为90%。在aGVHD模型鼠中输注Ad-EGFP-mMSCs,6天后行冰冻病理切片,共聚焦显微镜下发现mMSC可分布在肠道绒毛上皮组织下、肠粘膜肺部小血管上皮、肺泡上皮、支气管粘膜上皮、肝脏汇管区、肾小管上皮、脾脏实质区。第二部分:阻断ICOS-B7h信号通路对异基因反应性T淋巴细胞功能的影响及对aGVHD的防治作用可溶性共刺激分子,Inducible costimulator(ICOS)是1999年Hutlof等在激活的人外周血T细胞上新发现的CD28家族成员,结构与CD28相似、基因位点相近,配体为B7h。ICOS只表达在激活的T淋巴细胞表面。ICOS与B7h通路的主要功能为增强回忆增殖反应,维持T效应细胞活化、改变Th1/Th2亚群极化等。目前认为,Th1细胞是aGVHD的主要效应细胞。我们设想,如在Th细胞分化阶段进行干预,促使Th细胞向Th2分化,减少Th1型细胞因子的分泌,阻断aGVHD的起始细胞因子,就有可能达到防治aGVHD的作用,又保留GVL效应的目的。因此我们设计ICOS-Ig融合蛋白阻断ICOS-B7h通路,探讨是否能弱化T淋巴细胞的异基因反应性,从而作为一有效的控制aGVHD的治疗手段。一:建立稳定高效表达ICOS-Ig的CHO细胞株,纯化蛋白,蛋白鉴定方法:pSecTag2/Hygro A-ICOS-Ig质粒经Not-I、Sfi-I双酶切鉴定;脂质体法转染CHO细胞,HygroB 800ug/ml加压筛选得到高表达的稳定细胞株,ELISA法及SDS-PAGE鉴定蛋白表达。滚瓶大批量培养细胞,收集上清,Protein A柱亲和层析纯化蛋白,PBS透析、分子量及内毒素含量鉴定。结果:Not-I、Sfi-I双酶切质粒后,电泳显示目的基因片段为1046Kb,符合预期片断大小。质粒转染CHO细胞后,经HygroB 800ug/ml加压筛选,反复挑选单克隆,得到稳定高表达的细胞株,蛋白表达量可达563.022ng/mL。滚瓶体系培养,收集上清,SDS-PAGE鉴定还原条件下目标蛋白的分子量为54Kd,符合目的蛋白分子量,内毒素含量＜10EU/mL,符合体内外实验要求。二:ICOS-Ig融合蛋白对T淋巴细胞异基因反应性的影响方法:建立体外T淋巴细胞反应性增殖培养体系:1、C57BL/6小鼠来源的脾脏单个核细胞以2×10~5/mL接种,ConA 10ug/mL刺激;2、经磁珠分选后得到C57BL/6小鼠脾脏来源的纯CD4淋巴细胞,以1×10~5/mL接种作为反应细胞,BABL/C来源的脾脏单个核细胞经丝裂霉素灭活后,以2×10~5/mL作为刺激细胞,混合培养;3、经磁珠分选后得到C57BL/6小鼠脾脏来源的纯CD4淋巴细胞,以1×10~5/mL接种作为反应细胞,BABL/C骨髓源成熟树突状细胞经丝裂霉素灭活后,以1×10~4/mL作为刺激细胞,混合培养。在上述三种培养体系中,加入不同浓度梯度的ICOS-Ig干预,设立同浓度的人Ig(h-Ig)作为对照,每组5个复孔,实验重复3次,培养48—72小时后,CCK-8测定T淋巴细胞增殖变化、ELISA法检测细胞因子表达、流式检测T淋巴细胞活化及凋亡。结果:①阻断ICOS-B7h通路抑制T淋巴细胞的非特异反应性。ICOS-Ig≥20ug/mL时,以ConA为刺激原的T淋巴细胞增殖指数明显降低(P＜0.05);②阻断ICOS-B7h通路后,CD4~+T淋巴细胞对同种异基因单个核细胞的增殖能力下降。ICOS-Ig≥40ug/mL时,以BABL/C脾脏来源的单个核细胞为刺激原,C57BL/6小鼠的CD4~+淋巴细胞的增殖指数明显降低(P＜0.05);其培养上清中IFN-γ的分泌明显下降(P＜0.05);③阻断ICOS-B7h通路后,CD4~+T淋巴细胞对同种异基因抗原递呈细胞的免疫反应性下降。ICOS-Ig≥10ug/mL时,以BABL/C骨髓来源树突状细胞(Dendriticcell,DC)为刺激原,相比于单纯刺激组,C57BL/6小鼠的CD4~+淋巴细胞的增殖指数明显降低(P＜0.05);不影响该体系中的IFN-γ表达,但可促进IL-4的分泌(ICOS-Ig 20ug/mL:187.65±27.54 vs 527.20±26.54,P＜0.05);减少TNF-α的表达(ICOS-Ig 40ug/mL:1712.62±313.93 vs1025.07±156.51,P=0.02)。流式细胞术检测各组T淋巴细胞CD25的表达率均在98%以上,各组无统计学差别。ICOS-Ig浓度和CD4~+T淋巴细胞的凋亡比例成正相关:单纯刺激组、ICOS-Ig 10ug/mL干预组、20ug/mL干预组CD4~+AnnexinV~+PI~-细胞群的频率分别为:15.1%、26.4%、33.6%。三:ICOS-Ig融合蛋白对急性移植物抗宿主病的干预及机制探讨方法:建立以C57BL/6鼠为供体、致死剂量照射的BALB/C鼠为受体的aGVHD急性移植物抗宿主病动物模型,分别在移植0、+2、+4、+8天腹腔注射100ug的ICOS-Ig,以同浓度的人Ig作为对照。观察生存率、体重及临床GVHD症状的改变。移植后的+4天取小鼠脾脏单个核细胞行流式检测CFSE标记的供体T淋巴细胞增殖,+10天取脾脏来源的单个核细胞行流式检测供体T淋巴细胞凋亡;+14天取小鼠外周血上清测定细胞因子表达,取各组小鼠脾脏,抽提RNA,半定量测定转录因子表达。结果:①ICOS-Ig干预可显著延长aGVHD小鼠的生存时间,相比于h-Ig组,ICOS-Ig组的中位生存时间显著延长(10天vs 20天,p=0.0217,n=14);肠道粘膜病变及肝脏汇管区淋巴细胞浸润明显减少;②ICOS-Ig不影响aGVHD环境中异基因T淋巴细胞的增殖,但缩短其生存时间。移植后第3天流式细胞术检测小鼠脾脏CFSE标记的供体T淋巴细胞增殖状态。h-Ig、ICOS-Ig组CD4~+CFSE~-细胞群的频率分别为:(98.88±0.76)%、(99.71±0.27)%,两组之间无统计学差异;CD8~+CFSE~-细胞群的频率分别为:(98.62±0.63)%、(99.53±0.51)%,两组之间无统计学差异。移植后第10天流式细胞术检测小鼠脾脏来源的T淋巴细胞凋亡状态。h-Ig、ICOS-Ig组(n=5)的CD4~+AnnexinV~+PI~-细胞群的频率分别为:(15.72±7.34)%、(22.78±6.94)%,p=0.078;CD8~+AnnexinV~+PI~-细胞群的频率分别为:(15.7±9.59)%、(25.92±5.66)%,p=0.032,具有明显统计学差异;③ICOS-Ig不影响T淋巴细胞亚群的组成及供体来源的T淋巴细胞在aGVHD靶器官中的分布。h-Ig、ICOS-Ig组(n=5)的MHC-Ⅰ~+CD4~+/MHC-Ⅰ~+CD8~+的比例分别为:26.35±0.07/22.12±0.04,p=0.44。供体来源的CD4~+、CD5~+T淋巴细胞在aGVHD靶器官组织(肝、脾)中的绝对数值两组无明显差异;④ICOS-Ig抑制异基因T淋巴细胞的再次活化功能。移植后第10天分离小鼠脾脏来源的T淋巴细胞。体外ConA刺激48小时后,CCK-8测定T淋巴细胞增殖,相对于h-Ig组,ICOS-Ig组的增殖指数显著降低(0.86±0.04 vs 0.69±0.12,P＜0.05);⑤ICOS-Ig减少Th1类细胞因子的分泌,增加Th2类细胞因子的分泌。移植后14天,相比h-Ig组,ICOS-Ig组外周血上清中IFN-γ的分泌明显减少(562.27±49.97 vs 49.791±2.805,P＜0.01);IL-4的分泌明显增加:(38.819±27.56vs 456.03±69.63,P＜0.05);⑥ICOS-Ig改变脾脏转录因子的表达。移植后14天,Real-time PCR测定各组小鼠脾脏来源的T-bet及GATA-3表达量。相对于h-Ig组,ICOS-Ig组脾脏的T-bet相对表达量减少(5.9±1.22 vs 3.27±1.61,P=0.15);GATA-3的相对表达量明显增加(2.82±1.08 vs 5.35±0.48,P=0.03);T-bet/GATA-3的表达比例明显减少(1.87±0.65 vs 0.56±0.35,P=0.03)。结论:(1)1×10~5/只(5×10~6/Kg)的mMSCs不仅可成功预防GVHD、也具有治疗GVHD的作用,但增加mMSCs的数量(5×10~5/只)并没能进一步提高生存率;(2)mMSCs不影响aGVHD环境中异基因T淋巴的增殖,但缩短其生存时间;(3) mMSCs减少Th1类炎症因子的表达,抑制异基因T淋巴细胞的二次活化功能;(4) mMSCs在aGVHD模型中可广泛分布至肠道粘膜、肺泡及支气管粘膜上皮、肝脏、肾小管上皮及脾脏实质区,可能参于aGVHD靶器官的修复;(5)成功纯化ICOS-Ig融合蛋白,体外实验证实阻断ICOS通路可抑制T淋巴细胞的非特异反应性;通过缩短活化后的CD4~+T淋巴细胞存活时间,降低CD4~+T淋巴细胞对同种异基因单个核细胞及抗原递呈细胞的增殖能力;改变Th细胞的极化、不影响CD4~+T淋巴细胞的活化功能;(6)阻断ICOS-B7h通路可明显减少aGVHD的死亡率,减轻靶器官损害;(7)阻断ICOS-B7h通路不影响aGVHD环境中异基因T淋巴细胞的增殖,但缩短其生存时间,抑制其体外再次活化功能;(8)阻断ICOS-B7h通路减少aGVHD环境中Th1类细胞因子的分泌,增加Th2类细胞因子的分泌。抑制Th1类特异性转录因子T-bet的表达,而增加Th2特异性转录因子GATA-3的表达,从而改变Th辅助细胞的极化状态。