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超氧化物歧化酶是体内自由基主要清除剂之一,简称为SOD。现已证明树莓是富含SOD的水果资源。本文首先以树莓为原料,通过盐析、凝胶层析等步骤对树莓SOD进行提取纯化,然后针对SOD作为药用酶稳定性差的缺陷,对树莓SOD进行了化学修饰与固定化研究。这些为对树莓SOD的进一步深入研究及其在药品、保健食品和化妆品方面的应用打下了一定基础。
本文在前人研究的基础上,拓展了关于SOD化学修饰的新思路:在对SOD进行分子改造的同时,着重于扩展其功能,使之成为具备复合型功能的酶分子。本文选用了具备清除自由基、增强免疫等功能的壳聚糖作为修饰剂对SOD进行改造。
首先,应用四种氧化降解法,主要包括:H<,2>O<,2>降解法、HAC-H<,2>O<,2>降解法、H<,2>O<,2>-NaClO降解法和NaBO<,3>降解法,在优化条件下制备了四种低聚水溶性壳聚糖。用四种低聚水溶性壳聚糖对树莓SOD进行化学修饰,H<,2>O<,2>降解法制备的低聚水溶性壳聚糖作为修饰剂得到的修饰酶总活力较高,可达到712.38U/mL。SOD经H<,2>O<,2>降解法制备的低聚水溶性壳聚糖修饰后,SOD氨基修饰率为59.27%,SOD活性保持度为63.12%。修饰SOD的温度稳定性、pH稳定性均明显提高,同时与天然SOD相比,修饰SOD的木瓜蛋白酶酶切耐受性明显增强。修饰SOD的体外半衰期为486.71h,天然SOD的体外半衰期为94.27h,修饰酶的体外半衰期较天然酶体外半衰期延长了约四倍。结果表明,低聚水溶性壳聚糖修饰SOD是可行的,低聚水溶性壳聚糖可作为一种较好的修饰SOD的化学修饰剂。
壳聚糖具有良好的生物相容性和生物降解性,分子中游离氨基多,反应活性好,是固定化酶的良好载体,有着广泛的应用前景。
本文对壳聚糖采取不同处理方法,将其用于对树莓SOD进行固定化,比较酶活力及酶活回收率,筛选出了较优的壳聚糖载体的制备方法,结果表明,壳聚糖粉固定化SOD和网状壳聚糖固定化SOD,酶活力和酶活回收率均较理想。分别确定了壳聚糖粉固定化SOD和网状壳聚糖固定化SOD制备的最佳条件,并考察固定化SOD的酶学性质。
壳聚糖粉固定化SOD研究表明,以壳聚糖粉为载体,戊二醛交联法制备固定化SOD,优化条件下活化中戊二醛浓度取0.4%制备的固定化酶,所得壳聚糖酶粉活力192U/g,酶活回收率为34%,热稳定性和酸碱稳定性较天然酶有很大的提高,且具有良好的贮存稳定性,固定化酶粉可实现反复使用,提高了利用率,壳聚糖粉可用于制备固定化SOD。网状壳聚糖固定化SOD研究表明,以网状壳聚糖作为载体,戊二醛为交联剂,在最佳固定化反应条件下,网状壳聚糖载体制备过程中,戊二醛浓度取1.0%,固定化反应中戊二醛浓度取0.1%,所得固定化SOD酶活力为330U/g,酶活回收率为58.33%,热稳定性和酸稳定性较天然酶有很大的提高,且具有良好的贮存稳定性,固定化酶可实现反复使用,提高了利用率。结果表明,以戊二醛预交联的网状壳聚糖作为载体可用于制备性能较优的固定化SOD。