近视患者在临床上较早出现核性白内障,与年龄相关性白内障及皮质性白内障不同,此类白内障出现年龄较早,视轴影响较明显,是近视发病率较高的我国在未来即将面临的艰巨防盲问题。既往的流行病学研究中,已经有学者从临床病理形态学变化探讨了高度近视与白内障之间的因果关系,但是,他们往往忽略了轴性近视与屈光性近视的区别,导致部分屈光性近视患者混入从而干扰了相关研究结果,其发病机制的研究有待进一步挖掘和摸索。本文的研究工作正是立足于轴性近视的视轴变化所对应的黄斑中心凹位置改变,分为临床和基础两部分,初步探讨了核性白内障和轴性近视之间的密切关系。【目的】1.通过临床影像分析,检测不同眼轴的轴性近视患者的黄斑中心凹距视盘中心直线距离(d MO)、黄斑中心凹距视盘中心水平线的垂直距离(d MOv),黄斑中心凹距视盘中心线垂直线的水平距离(d MOh),并探讨轴性近视患者不同眼轴的黄斑中心凹位置变化情况,2.通过临床影像分析,检测合并核性白内障的轴性近视患者和单纯轴性近视患者的黄斑中心凹距视盘中心直线距离(d MO)、黄斑中心凹距视盘中心水平线的垂直距离(d MOv),黄斑中心凹距视盘中心线垂直线的水平距离(d MOh),探讨并发核性白内障后,这些指标的变化情况,以进一步研究轴性近视和核性白内障的相关性。3.通过蛋白质组学研究技术,筛选和鉴定正常眼轴的核性白内障患者、轴性近视合并核性白内障患者及轴性近视(无白内障)患者的前房水标本中的相关蛋白质,验证利用iTRAQ定量蛋白质组学联合质谱技术的可靠性和样本的适用性。4.通过蛋白质组学研究技术,比较正常眼轴的核性白内障患者、轴性近视合并核性白内障患者及轴性近视(无白内障)患者的前房水标本中的相关蛋白质,筛选和鉴定与轴性近视并发核性白内障相关的房水蛋白。作为进一步研究探索高度近视并发白内障的预防及治疗新靶点的理论依据。【方法】1.核性白内障的发生对轴性近视患者黄斑中心凹位置变化的影响1.不同眼轴的近视患者的黄斑中心凹位置变化情况选取96位高度近视患者的186例眼球,患者年龄18~81岁、平均年龄(41.53±18.14)岁,等效屈光度数-6.00~-31.50D、平均为(-12.60±6.00)D,眼轴24.75-26.10mm,平均(28.76±2.61)mm。按照其眼轴长度分为4组:眼轴<26mm为AL1组,26眼;≥26mm~<28mm为AL2组49眼;≥28mm~<30mm为AL3组,38眼;≥30mm为AL4组,73眼。通过DRI-OCT Atlantis、眼底照相、IOLMsater等影像设备收集影像图片,并测量轴性近视患者的黄斑中心凹距视盘中心直线距离(d MO)、黄斑中心凹距视盘中心水平线的垂直距离(d MOv),黄斑中心凹距视盘中心线垂直线的水平距离(d MOh),并进行统计学分析。2.核性白内障的发生对轴性近视患者黄斑中心凹位置的影响选取63位高度近视患者的126例眼球,年龄28~81岁、平均年龄(58.21±10.79)岁,等效屈光度数-6.00~-31.50D、平均为(-10.91±5.53)D,眼轴26.75-36.10mm,平均(28.23±3.04)mm。按照有无核性白内障分为两组:无核性白内障Age2组,36眼;合并核性白内障Age3组,90眼。通过DRI-OCT Atlantis、眼底照相、IOLMsater等影像设备收集影像图片,并测量患者的d MO、d MOv、d MOh,并进行统计学分析。2.核性白内障和轴性近视患者的房水蛋白质组学研究1.样品蛋白质的相关验证收集25例核性白内障患者或轴性近视或合并核性白内障和轴性近视的患者的前房水,并分为三组:A组(核性白内障,正常眼轴)5例,平均年龄79.3±4.9岁,平均眼轴23.0±0.4mm;B组(核性白内障,轴性近视)9例,平均年龄80.8±4.1岁,平均眼轴28.5±1.5mm;C组(无白内障,轴性近视)11例,平均年龄21.1±10.5岁,平均眼轴30.1±7.9mm。每组内病例随机混样成8个样品:A组2个样本、B组3个、C组3个,抽取样本进行BCA法蛋白定量和预质谱分析。2.高效液相色谱联合iTRAQ标记串联质谱鉴定和定量蛋白质组的效果评估收集的25例房水样本进行裂解、酶解后分别进行稳定同位素(113、114、115、116、117、118、119和121)iTRAQ标记后经高分辨色谱仪串联分析,鉴定和定量蛋白质,并对肽段和蛋白质的定性、定量进行系统性评估。3.高效液相色谱联合iTRAQ标记串联质谱鉴定、筛选不同眼轴的核性白内障患者房水中的差异蛋白质将iTRAQ标记后经高分辨色谱仪串联分析的25例房水其中的样14例样本进行分组:A组(核性白内障,正常眼轴)5例,平均年龄79.3±4.9岁,平均眼轴23.0±0.4mm;B组(核性白内障,轴性近视)9例,平均年龄80.8±4.1岁,平均眼轴28.5±1.5mm。对其得到的蛋白质定量后进行对比分析,挑选出差异蛋白质。4.高效液相色谱联合iTRAQ标记串联质谱鉴定、筛选有否核性白内障的轴性近视患者房水中的差异蛋白质将iTRAQ标记后经高分辨色谱仪串联分析的25例房水其中的样20例样本进行分组:B组(核性白内障,轴性近视)9例,平均年龄80.8±4.1岁,平均眼轴28.5±1.5mm;C组(无白内障,轴性近视)11例,平均年龄21.1±10.5岁,平均眼轴30.1±7.9mm。对其得到的蛋白质定量后进行对比分析,挑选出差异蛋白质。【结果】1、不同眼轴的近视虽然在数据上AL2、AL3、AL4组比AL1组d MOv增加,但是总体而言,不同眼轴的近视患者在黄斑中心凹位置变化上并无明显差别。2、Age3组dMOv较Age2组增大,差异有统计学意义说明,在避免屈光性近视的干扰的情况下,轴性近视患者在并发核性白内障后,其黄斑中心凹位置会呈垂直方向移位。3、经随机选取的25例前房水样本中的8个样本进行的蛋白质验证实验证明:样本的蛋白质提取正常,含量适中,质量良好,可以进行进一步的高效液相色谱分析。4、采用的高效液相色谱联合iTRAQ标记串联质谱方法来同时比较了25例样品之间的蛋白质表达量,其最终鉴定到蛋白质918个。5、经过差异性比较,我们可以看到根据眼轴不同的A(5例)和B(9例)组,鉴定到差异蛋白74种。其中,B/A上调蛋白4种,分别为:A0A140TA29(Complement C4-B补体C4B)、A0A0M3KKW6(Fab Hu 15C1Heavy chain Fab片段15C1)、A0A0F7T6Q1(IGHV1-2蛋白)和P19827(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1,α-胰蛋白抑制酶),即在长眼轴的核性白内障组(B)中高表达,在正常眼轴的核性白内障组(A)中表达少;B/A下调蛋白70种,即在长眼轴的核性白内障组(B)中低表达,在正常眼轴的核性白内障组(A)中高表达,其中P值小于0.01的19种,P值小于0.001的两种,分别为:A8K5N5(c DNA FLJ78142)和V9HWE9(Epididymis secretory protein Li 22附睾分泌蛋白22)。6、经过差异性比较,我们鉴定到轴性近视合并核性白内障患者(B组)和透明晶体合并轴性近视患者(C组)中共有186种差异蛋白。其中,B/C上调39种,即它们在合并轴性近视的核性白内障组(B)中高表达,在轴性近视的无白内障组(C)中低表达,其中A2RRD8(Zinc finger protein 320,锌指蛋白320)蛋白质表达的差异性最大,比例接近5.4。而147种B/C下调蛋白中则无显著差异性蛋白,即在轴性近视并发核性白内障患者(B)中表达较少,而在轴性近视无白内障患者(C)中表达较多,但其中有两个P值<0.0001的蛋白为:A0A0K0K1J1(Cystatin抑半胱氨酸蛋白酶蛋白)和A6XND5(Ribonuclease T2核糖核酸酶T2)。【结论】1.不同眼轴的近视患者在黄斑中心凹位置变化上并无明显差别,因而,黄斑中心凹位置可以作为轴性近视的一个稳定恒量,从而作为能有效避免屈光性近视的、干扰的一项平均指标。2.轴性近视并发核性白内障患者的黄斑中心凹距视盘中心水平线的垂直距离(d MOv)较单纯轴性近视患者增大,差异具有统计学意义。从而说明,轴性近视患者在发生核性白内障后,其黄斑中心凹位置会呈垂直方向移位。3.基于高效液相色谱联合iTRAQ标记串联质谱法是一种高效的研究手段,可以有效的鉴定出房水中的蛋白质组学成分并进行定量分析,然后筛选出差异性蛋白。这对于较难取得样本的眼科基础研究有较好的临床前景。4.利用同位素iTRAQ标记联合质谱技术的方法,鉴定出了房水中918种蛋白质,而在核性白内障患者和轴性近视的比较中,我们筛选出两者的差异性蛋白240种,其中有明显差异性的8种,分别为:A0A140TA29(Complement C4-B补体C4B)、A0A0M3KKW6(Fab Hu 15C1 Heavy chain Fab片段15C1)、A0A0F7T6Q1(IGHV1-2蛋白)、P19827(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1,α-胰蛋白抑制酶)、A8K5N5(c DNA FLJ78142)、V9HWE9(Epididymis secretory protein Li 22附睾分泌蛋白22)、A2RRD8(Zinc finger protein 320锌指蛋白320)、A0A0K0K1J1(Cystatin抑半胱氨酸蛋白酶蛋白)、A6XND5(Ribonuclease T2核糖核酸酶T2)。这些筛选出来的显著差异性蛋白主要涉及免疫系统、氧化损伤和诱导发育系统,从而为下一步研究致病基因或发现诱因提供了可靠客观的信息来源。