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研究目的:实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是一种慢性炎症性疾病,是人类多发性硬化症(Multiple sclerosis,MS)的经典小鼠模型,其特征在于中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)炎症脱髓鞘和轴突破坏导致的神经系统退化。研究表明,EAE的发病机制是由血脑屏障的破坏以及小胶质细胞和淋巴细胞的激活引起的。小胶质细胞是中枢神经系统中的先天性免疫细胞,是为神经元提供执行自噬体/溶酶体功能的关键细胞。自噬是细胞分解代谢的过程,其作用是在细胞受到应激等相关刺激时维持细胞的稳定。异常自噬参与许多病理机制的发生发展,例如癌症,自身免疫性疾病和神经退行性疾病。因此,研究自噬的调节机制至关重要。有研究证实,micro RNA(mi RNA)可作为调节自噬的新型且高效的调节剂。我们研究发现Mir223敲除可显著改善中枢神经系统炎症,缓解EAE的临床症状,增加中枢神经系统中静息小胶质细胞的数量和自噬活性,但是具体机制尚不明确。因此,本实验研究了Mir223如何通过调节自噬进而调控中枢神经系统炎症的作用机制。方法:通过体内试验对Mir223KO鼠和WT鼠建立EAE模型,实时监测并记录小鼠的发病情况,发病评分,从而确定Mir223与疾病严重程度的关系。并且在EAE发病高峰期,取EAE发病的Mir223KO鼠和WT鼠的脊髓组织,切片后进行H&E和Fast Blue染色,观察并比较两组小鼠中枢神经系统中炎细胞浸润和脱髓鞘的情况。分离小鼠发病高峰期脑和脊髓组织内的小胶质细胞,流式检测静息状态下的小胶质细胞的数量,比较两组小鼠的差异;同时取发病高峰期小鼠的脑组织切片做自噬相关蛋白的免疫荧光染色,检测Mir223敲除后对自噬水平的影响。为确定Mir223是否通过自噬途径调节CNS炎症,引入自噬抑制剂3-MA(三甲基腺嘌呤),再次建立Mir223KO鼠和WT鼠的EAE模型,观察并记录小鼠死亡率、体重变化以及发病评分,进而确定Mir223通过调节自噬对CNS炎症的作用。体外试验利用LPS/Starvation诱导小鼠小胶质细胞系BV2自噬,Western blot检测自噬相关蛋白ATG16L1(Autophagy Related 16-Llike1)和LC3(Microtubuleassociated Protein 1 Light Chain 3)的表达水平,加入Mir223inhibitor后,电镜下观察Mir223的改变对自噬泡数量的影响。通过生物信息学的方式,预测Mir223可能作用的下游靶点,通过双荧光素酶报告基因和PCR检测等实验方法做进一步的验证。通过Western blot验证Mir223调节自噬的信号通路。结果:体内试验中,我们发现敲除Mir223表达可降低实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病小鼠的临床评分,提高生存率,改善临床症状。除此之外,分离EAE小鼠中枢神经系统(CNS)的小胶质细胞经流式检测发现,Mir223敲除后可增加CNS中静息状态的小胶质细胞的数量;免疫荧光染色结果显示Mir223敲除增强自噬活性。在自噬抑制剂3-MA的作用下,我们发现Mir223有可能通过调节自噬途径参与EAE的发生发展。通过进一步的体外试验发现,Mir223可抑制自噬的发生;抑制Mir223的表达可以促进自噬,进而减轻CNS的炎症,改善脱髓鞘的情况。利用生物信息学的方式以及反复验证,我们确定ATG16L1是Mir223通过自噬起作用的直接靶点,同时我们还验证了Mir223调节自噬并不通过Bcl2和Beclin1通路。结论:上述结果表明,敲低Mir223的表达可改善实验性自身免疫性脑脊髓炎EAE的临床症状,降低临床发病评分,从而抑制脱髓鞘,减轻中枢神经系统炎症。Mir223可以通过直接作用于ATG16L1抑制自噬,进而促进中枢神经系统的炎症。综上所述,我们数据表明Mir223是一种新型的自噬调节因子,ATG16L1是Mir223的直接靶点,可能为多发性硬化症的诊断和治疗提供新思路。