睾丸间质细胞（Leydig cell）是位于睾丸曲细精管间质之间的一类类固醇激素合成细胞，它能合成分泌雄性激素，这对于精子的发生、男性生殖器官发育，以及维持第二性征和性功能都是至关重要的。睾丸间质细胞，作为雄性体内最主要的雄激素来源，其发育过程及功能受到了各种环境因素的影响。　　丁基羟基茴香醚（BHA）是一种人工合成的抗氧化剂，目前被广泛用于长期保存食品、化妆品和药品。虽然BHA在一般情况下被认为是安全的，但目前它已被归类为一种可疑的内分泌干扰物。已有研究证实BHA是一种局部雌激素受体激动剂，同时也是一种抗雄激素。然而，BHA是否影响雄激素的生物合成？它的作用机制又是怎样的？这些都尚不清楚。　　实验目的：　　本研究的目的是调查 BHA对大鼠未成熟睾丸间质细胞类固醇激素合成的影响及其作用机制。　　实验方法：　　本研究采用35日龄雄性SD大鼠作为实验对象，分离纯化其未成熟睾丸间质细胞，用含不同浓度BHA（0.05、0.5、5和50μM）的加有10ng/ml黄体生成素（LH）的培养基体外培养3h，并设对照组（0μM，乙醇，为 BHA溶媒）。孵育3h后，收集培养液上清，用放射免疫分析技术测定培养液上清中的5α-雄烷-3α,17β-二醇（DIOL）和睾酮（T）含量，确定 BHA对未成熟睾丸间质细胞中雄激素产量的影响。在此基础上，用50μM BHA分别联合不含LH、含10ng/ml LH、10mM8Br-cAMP、20μM各种类固醇（为类固醇激素合成酶的底物，包括22R-羟基-胆固醇、孕烯醇酮、孕酮、雄烯二酮、睾酮和双氢睾酮）的培养基体外培养未成熟睾丸间质细胞3h后，收集培养液上清，用放射免疫分析技术测定培养液上清中的DIOL和T含量；收集未成熟睾丸间质细胞，提取细胞RNA，进行逆转录合成cDNA，然后运用实时荧光定量PCR（Q-PCR）技术，检测BHA对未成熟睾丸间质细胞相关基因：Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Srd5a1和Akr1c14 mRNA表达水平的变化；收集正常35天龄 SD雄性大鼠睾丸匀浆制备微粒体，在微粒体-底物混合液中加入BHA，采用同位素示踪法分别检测催化产物孕酮、雄烯二酮、睾酮和双氢睾酮的转化率，从而确定BHA对3β-羟基类固醇脱氢酶1（HSD3B1）、17α-羟化酶/17,20裂解酶（CYP17A1）、17β-羟基类固醇脱氢酶3（HSD17B3）和类固醇5α-还原酶1（SRD5A1）活性的直接影响。　　实验结果：　　研究发现，经不同浓度 BHA（0.05-50μM）处理后，未成熟睾丸间质细胞分泌雄激素的总产量（T+DIOL）均有所降低，其中50μM BHA处理组与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.001）。50μM BHA剂量组的未成熟睾丸间质细胞中LH-和8Br-cAMP-介导的雄激素的总产量（T+DIOL）明显低于对照组，其中主要表现为DIOL产量受到明显抑制，而T产量无明显变化。进一步研究BHA处理抑制雄激素分泌的作用机制发现，BHA为50μM时，可以直接抑制大鼠睾丸中CYP17A1和HSD3B1的活性，并减少Hsd17b3和Srd5a1 mRNA相对表达量及其相应蛋白表达水平。　　实验结论：　　BHA可以直接抑制大鼠未成熟睾丸间质细胞中 CYP17A1和HSD3B1的活性，并减少Hsd17b3和Srd5a1基因表达水平，从而导致大鼠未成熟睾丸间质细胞中雄激素产量降低。