目的:膀胱癌是泌尿系统癌症中具有第二位致死性的疾病,也是世界上在男性中第六位常见发病的恶性肿瘤。然而,在膀胱癌的临床治疗中存在一些不容乐观的现状,因此需要人们去探索、发展治疗的新策略。其中腺病毒介导的基因治疗在临床上的应用具有显著提高病人疗效的潜在价值,而且该方法还具备在治疗中保留膀胱的可能性。RNF8是一种泛素连接酶,它能促进DNA的损伤修复。RNF8在膀胱癌细胞中高表达,且这种高表达能由腺病毒介导的sh RNA处理而逆转。因此,本实验的目的是探索经由腺病毒介导的sh RNA敲低RNF8对膀胱癌的放疗效果的独特的靶向作用。方法:培养并收获处于对数生长期的三种膀胱癌细胞系T24、BIU87和5637用于免疫印迹实验以比较RNF8在膀胱癌细胞中的表达量,对取自膀胱癌病人的癌组织也通过免疫印迹实验比较其RNF8的表达情况。随后,应用免疫荧光染色实验来探测膀胱癌细胞中内源性RNF8的自发表达。接下来将膀胱癌细胞系暴露于2 Gy的X射线辐射中,通过免疫荧光试验来检测由DNA损伤引起的RNF8和γ-H2AX聚集的电离辐射灶(IRIF)。在膀胱癌细胞系中运用腺病毒介导的sh RNA来敲低RNF8的表达,随后用这些细胞进行一项克隆形成实验。用免疫印迹实验来验证RNF8敲低的效果。对Sh RNF8处理的细胞及其对照施加5 Gy的射线照射或不进行照射。通过免疫细胞化学方法对T24膀胱癌细胞系进行染色,实行TUNEL实验,以确定RNF8敲低引起膀胱癌对射线辐射的高敏感性的内在作用机理。进一步通过吖啶橙(AO)/碘化丙啶(PI)复染色法来研究T24膀胱癌细胞系在sh RNF8和电离辐射的双重处理下的凋亡情况。使用RNF8被敲低或未敲低的T24细胞来检验其受到电离辐射后的DNA损伤修复进程,γ-H2AX被用作不同时间点上的双链断裂检测标志物。实验中感染了腺病毒介导的sh RNF8或sh Null载体或未使用腺病毒感染的对照细胞被照射了5 Gy电离辐射。为了调查RNF8对膀胱癌细胞中组蛋白H2A和H2B的泛素化的作用影响,对被转染了sh RNF8或sh Null的T24细胞进行5 Gy电离射线照射,然后使用上述细胞裂解物做免疫印迹实验。为了进一步研究RNF8在膀胱癌细胞的DNA损伤修复中的作用,首先使用sh RNA敲低细胞中RNF8的表达,随后应用免疫荧光试验来检验几种不同的DNA损伤的信号或修复蛋白,包括MDC1、53BP1、BRCA1和RAP80所形成的由电离辐射引起而聚集的IRIF是否是RNF8依赖的。通过实行体内实验来进一步探索RNF8的这种作用是否也会在动物模型中重现。通过对裸鼠皮下注射T24细胞来建立膀胱癌肿瘤模型。当肿瘤明显形成后,这些裸鼠被随机分成sh RNF8和sh Null处理组。在肿瘤形成起的第1、3、5天时共三次分别对两组裸鼠的膀胱癌肿瘤内注射腺病毒载体。在处理的第5天时用免疫印迹实验来评估两组裸鼠的肿瘤样品里RNF8的表达情况。在第6天时让这些裸鼠照射电离射线,之后每3天检测一次肿瘤的生长情况。使用苏木精/伊红染色来检验对种植肿瘤的放射治疗的组织学状况。结果:实验组的3个膀胱癌细胞系中RNF8的表达相比于对照组正常的膀胱上皮细胞系SV-HUC-1有着明显的上调(P<0.05)。同时,在取自接受了根治性膀胱切除术的膀胱癌患者的癌组织样品中RNF8的表达相比于正常的膀胱癌旁组织也有着明显的提高(P<0.05)。免疫荧光试验的结果显示在膀胱癌细胞系中RNF8聚集的IRIF和γ-H2AX IRIF发生了清晰的共定位。克隆形成实验的数据表明,通过不同剂量的(2 Gy、4 Gy和8 Gy)电离辐射的两组未经腺病毒处理的和经sh Null腺病毒处理的膀胱癌细胞在每种电离辐射的剂量作用下均未表现出明显的存活差异,然而经sh RNF8腺病毒处理过的细胞却表现出相比于上述对照组存活率下降的现象。综上所述,说明RNF8下调能增强膀胱癌细胞对放疗的敏感性。未经射线照射的膀胱癌细胞均表现出低水平的凋亡现象。然而在对T24细胞照射5Gy电离辐射后,被sh RNF8处理过的细胞显示出显著高于对照细胞的TUNEL阳性率(P<0.01)。AO/PI复染试验的结果也提示被sh RNF8处理过的细胞的凋亡率比对照组高(P<0.001),这和TUNEL试验的结论保持一致。在电离辐射照射后的早期时间点(2小时和4小时),三组的γ-H2AX IRIF形成的数量没有明显的不同。然而在电离辐射照射后24小时,在未经腺病毒处理的和经sh Null腺病毒处理的膀胱癌细胞均展现出大部分的DNA双链断裂都已被修复时,经sh RNF8腺病毒处理过的细胞却表现出明显多于上述对照组的γ-H2AX IRIF(P<0.05)。在射线照射后的对照组膀胱癌细胞中泛素化组蛋白Ub-H2A和Ub-H2B的水平增加了,但是在RNF8沉默的细胞中无论是否照射了电离射线都表现出比sh Null处理过的对照组细胞更低的泛素化组蛋白Ub-H2A和Ub-H2B的水平。在RNF8沉默的膀胱癌细胞中,作用于RNF8上游的γ-H2AX和MDC1均在放疗后形成明显的IRIF。然而作用于RNF8下游的DNA损伤修复蛋白53BP1、BRCA1和RAP80均难以在DNA双链断裂位点聚集和维持存留。相比于sh Null处理的对照组,RNF8的表达在sh RNF8处理的实验组中有所下降。尽管在sh RNF8处理的实验组和sh Null处理的对照组中裸鼠的体型和重量没有明显的区别,但是在sh RNF8处理的实验组中膀胱癌肿瘤的生长比sh Null处理的对照组有着显著的减少。sh RNF8处理的实验组的肿瘤组织显示出比shNull处理的对照组更多的细胞坏死和凋亡。结论:泛素连接酶RNF8在膀胱癌细胞中高表达,腺病毒介导的sh RNF8可明显下调RNF8表达。RNF8能促进DNA损伤应答,而RNF8参与了放疗后膀胱癌细胞DNA损伤的修复,这个发现暗示了RNF8可能成为膀胱癌治疗的新靶点。克隆形成实验中由实验组细胞生存的减少证实了RNF8敲低能够使膀胱癌细胞对放疗的敏感性增强。其内在作用机制是,RNF8沉默会引起膀胱癌细胞在放疗后的高凋亡率以及双链断裂修复信号通路受损。这说明了对膀胱癌细胞联合施加sh RNF8和电离辐射的处理能通过在RNF8敲低的情况下引发凋亡和使双链断裂信号通路和修复因子级联产生缺陷而充分地提升放疗的效果。实验还证实了RNF8通过泛素化组蛋白H2A和H2B来参与放疗引起的DNA损伤应答。在裸鼠上的实验进一步展示出sh RNF8和放疗的联合作用能在体内抑制缩小膀胱癌种植肿瘤的生长和增强细胞凋亡坏死。