柑橘优异资源胚性愈伤组织诱导及体细胞杂种创制

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中国是柑橘重要原产地之一,柑橘资源丰富,有4000多年的栽培历史。柑橘胚性愈伤组织不仅可以长期离体保存,也是通过细胞融合创制新种质和建立柑橘可再生基因编辑体系的珍贵试材。因此,诱导和保存状态良好的胚性愈伤组织是柑橘生物技术改良的常规和必要工作。细胞融合技术可以有效缩短育种年限,实现核基因组和胞质基因组重组。柑橘细胞融合过程中,线粒体总是定向来自愈伤组织亲本,但其内在机制仍不清楚。基于以上背景,本研究以柑橘地方良种、部分主栽品种以及柑橘近缘属植物山金柑为材料,诱导其胚性愈伤组织;同时采用农杆菌介导的遗传转化创制稳定表达线粒体定位荧光蛋白的再生植株和愈伤组织细胞系,用于探索柑橘细胞融合过程中线粒体的遗传机制;采用不同亲本组合创制柑橘体细胞杂种,为柑橘育种和基础研究提供珍贵材料。主要结果如下:1.柑橘胚性愈伤组织诱导。以未发育胚珠/种子为外植体,通过诱导产生胚状体,共获得5个基因型的胚性愈伤组织,分别为山金柑DB系和SK系、椪柑(二倍体)、早金甜橙、‘国庆一号’温州蜜柑(G1),发现甜橙具有较强的体细胞胚发生能力;不同基因型的胚性愈伤组织通过未发育胚珠/种子-胚状体-胚性愈伤组织的途径而形成。2.用于细胞工程基础研究的转基因材料创制。采用农杆菌介导的遗传转化技术创制了稳定表达线粒体定位GFP、RFP荧光蛋白的G1愈伤组织系,以及稳定表达线粒体定位RFP的山金柑胚性愈伤组织系;同时创制了稳定表达线粒体定位GFP的早花柠檬再生植株20株,其中12株为纯转化系,8株为嵌合体,均已移栽至温室。3.原生质体融合获得再生材料。对6个柑橘亲本组合开展原生质体融合,其中2个组合获得再生植株:默科特橘橙+桃叶橙获得11棵再生植株;G1-MTGB(稳定表达线粒体定位GFP)+‘卡特’伏令夏橙获得4棵再生植株;而G1+小叶红橘获得6个胚状体,目前处于诱导生芽阶段。本研究还探讨了外植体选择及培养环境对诱导柑橘胚性愈伤组织的影响,展望了获得的胚性愈伤组织及稳定表达线粒体定位荧光蛋白的遗传转化材料的应用潜力。
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