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小麦纹枯病、小麦根腐病及小麦茎基腐病是目前小麦上三种重要的土传真菌病害,对小麦的品质和产量造成了严重的影响,这三种病害在发病初期较难区分,常错失防治时机。本研究针对这三种病害的病原设计特异性引物,建立可同时检测这三种病害的多重PCR体系,并将该体系应用于田间小麦样本,实现小麦土传真菌病害的快速检测;另一方面,利用高通量测序技术对小麦茎基腐病不同发生程度麦田的土壤微生物群落结构和多样性进行分析,解析土壤肥力状况及微生物群落结构与小麦茎基腐病的关系。主要研究结果如下:1、多重PCR体系的建立与应用(1)引物设计及PCR扩增根据禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)和麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)的rDNA-ITS、镰孢菌(Fusarium spp.)EF-1α基因序列独立设计并合成3对引物:WKF-S18/WKR-S8、RBF-S2/RBR-S1及EF-SF9/EF-SR8,3对引物扩增的基因片段大小分别为174、418、600 bp。(2)多重PCR反应体系优化为了在同一PCR反应体系中同时获得三条清晰的目的基因片段,首先优化了PCR退火温度,其次采用L18(3~7)正交设计方案,优化了5个因素的配比浓度:即3对引物的浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度。结果表明,多重PCR体系的最佳退火温度为54.9℃,最佳反应体系为引物WKF-S18/WKR-S8 0.24μmol/L,引物RBF-S2/RBR-S1 0.48μmol/L,引物EF-SF9/EF-SR80.24μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U,dNTPs 0.15 mmol/L。(3)多重PCR特异性检测以禾顶囊壳小麦变种、大丽轮枝菌等其他真菌DNA为模板,用该多重PCR引物组合进行扩增,未扩增到目的条带,说明该引物组合对三种目标菌的特异性良好。(4)多重PCR灵敏度检测分别将小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦茎基腐病菌基因组DNA以及三者混合模板的浓度从10 ng/μL依次10倍梯度稀释至10 fg/μL,在优化的反应体系条件下进行扩增。结果表明,单一PCR检测,小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦茎基腐病菌的灵敏度分别为10 pg、10 pg和100 pg;多重PCR同时检测3种病菌,小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦茎基腐病菌的检测灵敏度均为100pg。(5)田间小麦样本检测及结果验证2018年3月,利用优化后的多重PCR体系对来自德州夏津、临邑县;聊城的东昌府区、东阿县;潍坊寒亭区和泰安市郊区的小麦苗期样本进行检测,并于5月份,调查这四个地区采集点的小麦样本的发病情况,以验证多重PCR检测的结果。结果表明,德州地区检测到了纹枯病菌、根腐病菌和茎基腐病菌,但茎基腐病菌为优势致病菌;聊城地区检测到了纹枯病菌和茎基腐病菌;潍坊地区检测到了纹枯病菌;泰安地区检测到了纹枯病菌和茎基腐病菌。田间实际发病情况与多重PCR检测结果基本一致,说明小麦苗期样本多重PCR的检测结果可以为小麦土传真菌病害的早期诊断提供参考。2、小麦茎基腐病区土壤微生物多样性研究田间采集小麦茎基腐病发病严重的德州夏津新盛店麦田土壤及发病较轻的泰安郊区马庄的麦田土壤,比较二者土壤理化性质的差异并利用Illumina Miseq测序方法,对细菌16S rRNA V4区以及真菌ITS1进行双端测序,分析真菌和细菌结构以及多样性的差异。结果表明,发病较轻的泰安郊区马庄麦田,土壤肥力较高,真菌和细菌的物种多样性均较高,且细菌优势菌群有节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、水恒杆菌属(Mizugakiibacter)等,真菌优势菌群有青霉属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)、粗糙孔菌属(Trechispora)等;茎基腐病发病严重的夏津新盛店麦田,土壤肥力较低,细菌以及真菌的多样性均较低,且细菌优势菌群有类诺卡氏属(Nocardioides)、Iamia等,真菌优势菌群有镰孢属(Fusarium)、被孢霉属(Mortierella)、拟棘壳孢属(Pyrenochaetopsis)等。此结果暗示,小麦茎基腐病的发生可能与土壤肥力水平降低、物种多样性下降及土壤微生物群落结构中有益菌群种类减少等相关。