论文部分内容阅读
“睡美人”(Sleeping Beauty , SB)转座系统属于Tc1/mariner转座子家族,已失活了一千多万年。1997年Ivics等根据积累的系统发生数据,利用生物信息学的方法进行分子重建,终于使其恢复转座活性。近年来对“睡美人”转座系统转座效率和转座机理的研究表明SB转座子系统在转基因,基因筛选,促进外源基因表达及基因治疗等领域具有广阔的应用前景。本研究利用“睡美人”转座子系统,比较睾丸直接注射法和SB系统介导下睾丸注射法转基因小鼠的制备效率,并分析了SB系统中的转座酶基因对基因免疫的增强作用。首先从本实验室已构建的精囊腺组织特异性表达载体(PC-EGFP)切出8.4kb含有EGFP的cDNA及其5’和3’调控序列表达片段,插入到“睡美人”转座子载体PT2-HB中获得PT2-EGFP。随后对睾丸直接注射制备转基因小鼠方法进行初步优化,利用已构建的SB系统和经过双酶切PC-EGFP获得的8.4kbDNA片段分别进行睾丸注射制备转基因动物,利用PCR方法比较转基因动物的制备效率,并对“睡美人”转座子与转座酶的比例进行了初步的摸索。研究结果表明,用4号针头,进行3次注射的公鼠与野生型ICR母鼠合笼后代的产子数及转基因阳性率较理想;经PCR并结合精囊腺和阴道栓的表达检测,SB系统介导的转基因阳性率(43%左右)显著高于普通8.4kb DNA片段的注射组(20%左右),“睡美人”转座子与转座酶的比例在5:1-20:1范围,后代的阳性率差异不显著。本试验同时构建了表达人乳铁蛋白(human lactoferrin,hLF)的真核表达载体pA-hLF,在进行家兔人乳铁蛋白多抗的制备过程中,按照“睡美人”转座酶:PA-LF=4:1的比例用PEI包裹后注射新西兰家兔,并设置PA-LF与PEI包裹,裸露的PA-LF两个注射组与对照组,以评价“睡美人”转座酶对于外源基因表达的促进作用。结果表明:“睡美人”转座酶与PA-LF注射组其抗体效价可达1:6400,高于PEI包裹PA-LF组(1:1600)和裸露质粒注射组(1:2000)。研究结果表明“睡美人”转座酶对基因免疫具有促进作用,可作为一种新型基因佐剂在抗体制备过程中发挥一定的作用。