鼠疫耶尔森氏菌是(Yersinia pestis,以下简称“鼠疫菌”)是引发烈性传染病鼠疫的病原菌,是一种革兰氏染色阴性的短小杆菌。而且,鼠疫菌在不同的培养条件或宿主环境下会呈现不同的形态。鼠疫菌染色体基因组大小约为4.65 Mb,包含约4000个基因。大多数的鼠疫菌菌株都包含3种质粒:p PCP1,p CD1和p MT1,3种质粒上包含有大量重要的毒力因子,对于鼠疫菌在宿主体内生存、传播以及致病有着重要意义。鼠疫菌进入人体后,感染初期会在几天内迅速扩散至人体的淋巴结形成腺鼠疫(bubonic plague);一旦进入血液经大量繁殖后容易引发败血症鼠疫(septicemic plague),并进一步扩散至脾、肝、肺等器官和组织;最终,一部分患者会发展为肺鼠疫(pneumonic plague),病原菌可以直接通过空气传播给其他人,易传播且致死率高。鼠疫菌引发的烈性传染病曾在世界范围内引发3次大流行,给人类带来了深重的灾难,并在一定程度上影响了各民族的政治、经济和文化。而且,近些年来世界卫生组织(WHO)将鼠疫列为重新抬头的传染病。鼠疫防治的研究工作仍然显得十分重要。鼠疫菌由其祖先假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis,以下简称“假结核菌”)进化而来,然而完全区别于假结核菌的传播方式,在自然界中,鼠疫菌通过节肢动物跳蚤的叮咬在宿主动物间进行循环传播,携带病原菌的跳蚤偶然间叮咬到人类会引发人间鼠疫。鼠疫菌在跳蚤体内传播时,会形成致密的生物被膜堵塞跳蚤的前胃,形成所谓的“菌栓”,使得跳蚤吸食的血液无法进入胃内消化,跳蚤时刻处于饥饿状态,反复叮咬宿主从而促进了鼠疫菌的传播。因此,鼠疫菌生物被膜的产生对于其经蚤传播的能力是具有重要意义的。鼠疫菌拥有复杂而精确的调控网络控制着各个生物被膜形成决定性因子以及毒力因子的激活和抑制,这其中各级调控子的协同作用对于鼠疫菌的致病和传播有着重要意义。目前的研究表明,许多重要的调控子以及它们调控的靶标基因在鼠疫菌生物被膜形成以及病原菌致病性中扮演着重要角色。鼠疫菌中hms HFRS操纵子坐落于染色体上的pgm位点内,负责合成和运输多聚β-1,6-N-乙酰-D-氨基葡糖(poly-β-1,6-N-acetylglucosamine exopolysaccharide)类似的多糖化合物,是生物被膜基质的主要成分,与鼠疫菌菌落能否被刚果红染料染色有直接关系。环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)是一个在细菌内广泛存在的第二信使分子,影响细菌毒力因子的表达和生物被膜形成。在鼠疫菌内,Hms T和Hms D是仅有的两个鸟苷酸环化酶能够催化c-di-GMP的合成,从而促进生物被膜的形成。然而,Hms P是鼠疫菌中唯一催化降解c-di-GMP的磷酸二酯酶,从而抑制鼠疫菌生物被膜的产生。在革兰氏阴性菌中,脂多糖(Lipopolysaccharide)是构成外膜必不可少的主要成分。一般来说,脂多糖由三部分组成:脂质A,核心多糖(Kdo)和O抗原,而鼠疫菌的脂多糖仅由脂质A在糖基转移酶的催化下与Kdo连接。在鼠疫菌中,waa A,waa E和coa D构成一个三基因的操纵子waa AE-coa D。waa A编码的糖基转移酶催化Kdo连接到脂质A上,而waa A缺失后的鼠疫菌也表现出明显的生物被膜形成缺陷。waa E编码的蛋白对于核心多糖链内庚糖的修饰起到关键作用,而研究表明waa E缺失后体外培养细菌时生物被膜形成约有40%左右的降低。这说明了鼠疫菌生物被膜的形成和脂多糖的合成有着重要联系。在鼠疫菌中,p H6抗原是重要的黏附因子以及毒力因子。p H6抗原的合成和分泌需要两个相邻的操纵子基因簇的参与,即psa ABC和psa EF。psa EF可以编码调控子蛋白促进psa ABC的表达。重要的毒力调控子Rov A和Pho P可以通过直接结合psa ABC和psa EF的启动子区结构,分别激活和抑制它们的表达。p H6抗原可以通过介导鼠疫菌黏附到肺泡上皮细胞,对于鼠疫菌引发小鼠腺鼠疫和肺鼠疫的发生都有重要的贡献。Rov A是Mar R/Sly A家族的调控子,影响着许多细菌大量毒力基因的表达,在三种致病型耶尔森氏菌的毒力基因调控中都扮演重要角色。许多Mar R家族的转录调控子,例如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的Tca R,屎肠球菌(Enterococcus faecium)的Asr R,变异链球菌(Streptococcus mutans)的Rca R以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Sar Z/Sar A等,都有研究报道影响细菌生物被膜的形成,然而Rov A对于鼠疫菌生物被膜形成的调控机制还是未知的。Rov M是Lys R家族的一个转录调控子,它首次被发现是在假结核菌中,研究表明Rov M可以直接结合到rov A基因的启动子区并抑制其转录,而且Rov M影响假结核菌的侵袭能力、毒力及运动性等。许多Lys R家族的转录调控子,例如菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)的Pec T,胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)以及大肠杆菌(Escherichia coli)的Lrh A,都在细菌毒力及生物被膜基因调控方面影响重大。那么,Rov M在鼠疫菌毒力及生物被膜形成的基因调控网络中又扮演怎样的角色呢?本研究中,以Rov M和Rov A两个调控子作为主要的研究对象,通过生物被膜形成检测的相关表型实验如:结晶紫染色半定量实验、线虫虫卵发育实验、菌落表面形态观察等实验方法探究Rov M和Rov A对鼠疫菌生物被膜形成的影响。结果表明:Rov M能够促进鼠疫菌生物被膜的形成,而Rov A却抑制鼠疫菌生物被膜的形成。通过检测并比较鼠疫菌不同菌株之间细菌胞内c-di-GMP的含量探究Rov M和Rov A是否影响第二信使分子c-di-GMP的合成。结果表明:Rov M显著地激活c-di-GMP的合成,而Rov A却强烈地抑制c-di-GMP的合成。通过皮下感染以及静脉感染两种方式给小鼠注射鼠疫菌,绘制小鼠生存曲线来探究Rov M对鼠疫菌毒力的影响。结果表明:Rov M抑制鼠疫菌的毒力。在获得了表型实验结果后,进一步通过精细的基因调控实验如:引物延伸实验、实时定量荧光PCR实验、Lac Z报告基因融合实验以及凝胶阻滞实验等方法探究Rov M和Rov A对鼠疫菌生物被膜形成以及毒力相关的靶基因和调控子基因调控的分子机制。结果表明,Rov M通过激活hms HFRS、hms T、hms CDE的表达,并同时抑制hms P的表达促进鼠疫菌生物被膜的形成。然而,Rov M间接地抑制YPO1635-pho PQ-YPO1632的表达,却不影响waa AE-coa D、pho PQ-YPO1632和fur的表达。Rov A通过抑制hms T、waa AE-coa D、YPO1635-pho PQ-YPO1632和pho PQ-YPO1632的表达阻碍鼠疫菌生物被膜的形成。然而,Rov A却不影响hms HFRS、hms CDE、hms P、fur和rov M的表达。并且,Rov M通过直接抑制rov A的表达,且同时间接抑制psa ABC和psa EF的表达来抑制鼠疫菌毒力。同时,Rov M可以激活自身的表达,且在26°C下高表达而37°C下低表达。我们汇总本研究中的实验结果以及前期的研究成果,大胆的提出了Rov M和Rov A在鼠疫菌致病和传播中可能存在的调控通路。在跳蚤体内环境温度(26°C)下,Rov M处于激活状态,它可以通过调控生物被膜形成相关决定性因子来促进鼠疫菌生物被膜的形成,并且同时抑制Rov A的表达,使得Rov A作用的大量毒力因子处于被抑制状态,从而有利于增强鼠疫菌经蚤传播的能力。当鼠疫菌由跳蚤传播到哺乳动物体内后,其生存环境由26°C转变为37°C,此时Rov M的表达明显降低,导致生物被膜形成的相关决定性因子处于抑制状态,而原本表达处于抑制状态的Rov A得到激活,通过调控大量的毒力因子来增强鼠疫菌的致病性。因此,我们可以看出Rov M和Rov A在鼠疫菌调控网络中的重要地位,Rov M和Rov A分别通过激活和抑制鼠疫菌生物被膜的形成,并同时分别抑制和激活鼠疫菌的毒力来影响鼠疫菌经跳蚤的传播能力以及对哺乳动物或人类的致病性。当生长环境温度由26°C转变为37°C时,假结核菌中的Rov M表达水平无明显变化,而鼠疫菌中Rov M的表达水平却显著降低,这可能是由假结核菌进化到鼠疫菌过程中的一个适应性变化。