背景微小RNA (MicroRNA, miRNA)最先是由Ruvkun G在线虫中发现的具有调节细胞发育时序功能的小分子RNA。多项研究已证明,miRNAs参与了细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤形成等多种生物学过程的基因表达与调控。研究发现microRNA-21(miR-21)在多种心血管疾病中的表达均增加,并参与了细胞增殖和分化等过程。研究发现在动脉粥样斑块中miR-21的表达上调,但miR-21参与粥样硬化的机制仍需进一步研究。巨噬细胞在易损斑块形成、发展及破裂中的作用已被广泛研究,巨噬细胞凋亡的机制目前尚在研究中,目前的研究发现多种信号传导通路参与了巨噬细胞的凋亡。研究发现miR-21可通过下调PDCD4的表达来促进细胞增殖。另外,miR-21的过表达可以抑制正常细胞凋亡信号传导,抑制miR-21可促进细胞凋亡。因此,由miR-21介导的细胞凋亡可能是粥样硬化形成的一个机制,同时miR-21可能参与了巨噬细胞凋亡的过程。糖尿病病人冠状动脉粥样硬化的发生率显著增加,同时糖尿病也是心血管疾病发生的重要危险因素。既往研究发现巨噬细胞凋亡在糖尿病病人冠状动脉易损斑块形成中起重要作用。MiR-21是否参与了高浓度葡萄糖状态下的巨噬细胞凋亡过程尚未见报道。目的研究miR-21在高浓度葡萄糖作用下巨噬细胞中的表达情况,并探讨miR-21在高浓度葡萄糖刺激下抑制巨噬细胞凋亡的作用机制。方法1.细胞培养及处理：应用含10%胎牛血清的DMEM培养液,培养Raw264.7细胞50ml细胞培养瓶中,37℃细胞培养箱中孵育。细胞生长至近汇合状态时用细胞刮刀刮除细胞,重新种植于6孔或12孔板中。Raw264.7细胞生长至融合的70%-80%时,换1%血清的DMEM培养液,37℃继续孵育过夜,使细胞进入生长静止期,随后进行干预。应用不同浓度的葡萄糖(5.5mmol/L、 25mmol/L)及甘露醇(25mmol/L)分别处理Raw264.7细胞24小时。2.实时定量PCR方法：应用实时定量PCR (RT-PCR)方法检测Raw264.7细胞miR-21及PDCD4、 Caspase-3、PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,磷酸酶基因)mRNA的表达情况。3.寡核苷酸转染：应用miR-21抑制剂转染Raw264.7细胞。4. Western Blot分析：检测PDCD4、 PTEN、 Caspase-3蛋白在细胞中的表达情况。5.流式细胞仪分析：应用流式细胞仪检测巨噬细胞的凋亡情况。结果1.为研究高浓度葡萄糖对巨噬细胞中miR-21表达的调节作用,Raw264.7细胞在无血清的状态下,用25mmol/L葡萄糖和25mmol/L甘露醇分别刺激细胞0h、1h、3h、 6h、12h、 24h后收集细胞,检测miR-21的表达量。结果发现,HG可有效刺激Raw264.7细胞miR-21表达上调,而甘露醇高渗刺激巨噬细胞miR-21表达降低。HG刺激巨噬细胞miR-21表达增加上调还随刺激时间的增加而逐渐增加,提示HG刺激巨噬细胞miR-21表达的上调呈时间依赖性。与甘露醇高渗组相比,HG处理细胞1h后miR-21表达开始明显增加(P<0.01),6h时miR-21表达达到高峰(P<0.01),12h后表达开始降低。2.为了研究HG对Raw264.7细胞中PDCD4 mRNA表达的影响,Raw264.7细胞用葡萄糖和甘露醇分别处理细胞Oh、6h、12h、 24h、48h、72h后,检测PDCD4 mRNA的表达量。结果发现,在12h时HG刺激使Raw264.7细胞PDCD4 mRNA表达量明显下降(P<0.05),24h之后其mRNA表达量开始增加(P<0.01),而甘露醇在6h时可引起PDCD mRNA显著增加(P<0.01),之后对PDCD4的作用不明显。这表明HG对巨噬细胞PDCD4 mRNA表达的影响也刺激时间有关,12h之前降低其表达,之后表达增加。Western Blot进一步证实,HG处理巨噬细胞12h后,PDCD4蛋白表达量亦显著增加。本实验同时发现,HG可引起巨噬细胞PTEN mRNA和蛋白表达在12h内PTEN表达量明显下降(P<0.05)。3.为了研究高浓度葡萄糖对巨噬细胞凋亡的影响,Raw264.7细胞分别用HG和甘露醇孵育不用时间后(0h、24h、48h),用裂解细胞提取细胞蛋白质,western blot检测活化caspase-3的蛋白表达量。结果显示,与甘露醇组相比,HG能明显增加活化caspase-3蛋白表达量。HG处理Raw264.7细胞24h后,活化caspase-3蛋白表达量开始明显增加,48h时表达量增加更明显。HG处理Raw264.7细胞0h、24h、48h后,流式细胞仪检测巨噬细胞的凋亡情况。结果表明,与对照组相比,HG组巨噬细胞的凋亡明显增加,且呈时间依赖性。本实验同时发现,随着HG刺激时间的延长,坏死的细胞也逐渐增多。4.本研究应用miR-21抑制剂抑制Raw264.7细胞miR-21的表达后,再检测PDCD4和PTEN的mRNA和蛋白表达情况。结果显示,miR-21抑制剂巨噬细胞24h后,与对照组相比,miR-21的表达明显降低(P<0.01). Real-time PCR结果显示,与对照组相比,Raw264.7细胞转染miR-21抑制剂24h后,其PDCD4 mRNA表达量明显增加(P<0.01),这提示miR-21可以抑制PDCD4的表达；HG刺激组PDCD4 mRNA表达明显降低(P<0.05),进一步证实了HG能够降低PDCD4的表达。与HG刺激的对照组相比,miR-21抑制剂抑制细胞miR-21表达24h后再加入HG刺激细胞12h后的PDCD4 mRNA表达量也明显增加(P<0.05)。与单纯miR-21抑制剂组相比,抑制miR-21的巨噬细胞经HG处理后,其PDCD4的表达明显降低(P<0.01)。Western Blot的结果与Real-time PCR结果相同。与对照组相比,HG处理巨噬细胞后其PTEN的表达明显减低(P<O.05)；miR-21抑制组的巨噬细胞PTEN含量则明显增加(P<0.01)。与HG处理的对照组相比,抑制miR-21的巨噬细胞经HG处理后,其PTEN的表达亦增加(P<0.05),与单纯miR-21抑制组性比,其PTEN的表达明显降低(P<0.01)。结论1.miR-21在高浓度葡萄糖诱导的Raw264.7巨噬细胞中表达增加,这种表达上调呈时间依赖性。2.miR-21通过调节其靶基因PDCD4对高浓度葡萄糖诱发的巨噬细胞凋亡起保护效应。背景心血管疾病是我国目前人群死亡的首位死亡原因,近年来我国冠心病的发生率及死亡率逐渐上升。研究表明,血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇水平的升高是冠心病和缺血性脑卒中发生的独立危险因素之一,因此,对高胆固醇血症患者的防治必须给予高度重视。3-羟基-3-甲基戊二廝辅酶A还原酶抑制剂(HMG-CoA),俗称"他汀类",可通过抑制肝细胞内的胆固醇合成限速酶,降低胆固醇的合成,并通过增加低密度脂蛋白受体的表法来降低循环中低密度脂蛋白的水平。研究表明,患者从他汀类药物的临床获益绝大部分是通过其降脂作用,同时送些药物可在心血管疾病的多方面发挥其非降脂作用,包括改善内膜功能、增强动脉粥样硬化斑块的稳定性、降低氧化应激及炎症反应,抑制血管壁的血拴形成、抑制心肌纤维化等。研究表明高胆固醇血症患者心房纤颤的发生率増高。左心房有储存器功能、管道功能及助力泵功能送三个功能,通过送三个功能,心房可在生理及各种病理状态下发挥其作用。应用应变/应变率技术可评价高血压、代谢综合征、肥胖患者等的左心房功能,且应用此技术测定的也肌功能可以准确反映心肌本身的收缩舒张特性,同时并不受周围组织牵拉影响。本研究拟采用应变/应变率技术评价高胆固醇血症患者左心房功能的变化,并研究应用匹伐他汀钙后,高胆固醇血症患者左心房功能的变化。目的应用应变/应变率技术评价高胆固醉血症患者左心房功能的变化,评价匹伐他汀钙对高胆固醇血症患者左心房功能的影响。方法本实验设计为双盲随机研究,选取高胆固醇血症病人40例,根据匹伐他汀钙的用药量随机分为1mg剂量组和2mg剂量组,各20例。高胆固醇血症的诊断禄准为:空腹血清总胆固醇(TC)水平为5.72mmol/L<TC<12.7mmol/L和/或空腹低密度脂蛋白胆固醇(LD-C)水平为3.64mmol/L<TC<6.5mmol/L。选取与之年龄、性别相匹配的正常对照30例。入选病例均经过详细的体格检查、肝肾功能检查,采用西口子Sequoia C512超声仪行经胸超声也动图检查,使用脱机工作站软件Syngo US Workplace进行测量。应用SPSS17.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数+标准差表示,分类变量采用卡方检验比较,应用独立样本t检验对两组间参数进行比较,不同药物剂量组间心房功能比较采用单变量一般线性模型的方差分析进行比较,应用多元逐步回归分析影响左心房应变/应变率变化的独立危险因素。"结果1.对照组与髙胆固醇血症组治疗前、后临床基本指标比较五组患者性别、年龄、身高、心率无统计学差异;高胆固醇血症组2mg剂量i组治疗前、后体重及腰围较对照组增高,高胆固醇血症组体重指数与对照组比较或.有统计学差异;高胆固醇血症组收缩压、舒张压、脉压及平均动脉较对照组增高;高胆固醇血症1mg剂量组及2mg剂量组治疗后化T较对照组増高,2mg剂量组治疗前后rGGT较对照组增高,2mg剂量组治疗前AKP与AST较对照组略增高(P<0.05),高胆固醇血症组1mg、2雌剂量组治疗前后TP、化B较对照组均增高;高脂血症组治疗前TC、TG、L化-C均较对照组明显増高,应用匹伐他汀治疗8周后,TC、TG、LDkC均较治疗前明显降低,并与对照组无统计学差异,DDL-CkC水平治疗前后无统计学差异;高胆固醇血症1mg剂量组治疗前肌巧水平略高于对照组(P<0.05)。2.正常组与髙胆固醇血症组治疗前基本超声也动图资料的比较比较发现:高胆固醇血症1mg剂量组治疗前、后LA左右径较对照组増大,2mg剂量组LV内径大于对照组(P〈0.05);2mg剂量组治疗前、后A峰与对照组比较增高(P<0.05);2mg剂量组治疗前、后E/Em与对照组比较増高。LA前后径、A0、RV、LVEF、E峰、E峰/A蜂、Em、Am、Em/Am比较无统计学意义。3.对照组与高胆固醇血症组治疗前后心房功能指标的比较高胆固醇血症1mg剂量组及2mg剂量组治疗前S、SSR及ESR均低于对照组(PO).05),ASR无明显差异;应用匹伐他汀钙不同剂量治疗8周后,ESR均较治疗前有明显改善(P<0.05)。1mg剂量组及2mg剂量组治疗后ASR较对照组降低(P〈0.05)。进一步比较匹伐他汀钙1mg剂量组及2mg剂量组,发现两种不同剂量匹伐他汀钙组心房功能改变无统计学差异。4.左心房应变/应变率影响因素分析应用多元逐步回归分析方法对左心房应变/应变率影响因素进行分析。分析发现LA前后径、DDL-C、体重、平均动脉压力、LD-C、Em、家族冠心病史为S的独立影响因素。SSR的独立影响因素为HDL-C、LA前后径、冠心病、TC、ALB、BUN、体重及收缩压。LA前后径、年龄、心率及LA左右径为ESR的独立影响因素。结论1.高胆固醇血症患者必房功能较正常者心房存储器功能及管道功能受损,助力泵功能未见明显改变;2.应用匹伐他汀钙治疗8周后,高胆固醇血症患者血清TC、TG、11)心水平均降低,DDL-C水平无明显改变;3.应用匹伐他汀钙治疗8周后,高胆固醇血症患者心房管道功能较治疗前明显改善,不同药物剂量组间无明显统计学差异,左心房助力聚功能较治疗前降低。