【摘 要】
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为了进一步搞清Dkk1的作用机制,该研究进行了以下工作：1.应用PCR的方法构建了一系列LRP6缺失结构,并通过酶切图谱,细胞表面免疫染色及western blot鉴定,筛选出结构正确并可正
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为了进一步搞清Dkk1的作用机制,该研究进行了以下工作：1.应用PCR的方法构建了一系列LRP6缺失结构,并通过酶切图谱,细胞表面免疫染色及western blot鉴定,筛选出结构正确并可正确表达的克隆.2.在293T体外培养细胞体系中,应用细胞表面结合技术检测了各种LRP6的缺失结构与Dkk1的结合能力.3.应用荧光酶报告基因分析检测了各种缺失结构与wnt/fz协同作用激活Wnt信号的能力.结果表明Dkk1并不竞争LRP6与Wnt-Fz的作用位点,而可能是通过结合LRP6改变其构象从而干扰了LRP6与Wnt-Fz的结合.Dkk1的作用机制与迄今为止发现的其他的Wnt抑制因子截然不同,是间接的.我们选用爪蟾EST(express sequence tag）克隆,在96-孔板中系统操作,并程序控制Robert进行整体原位杂交操作,筛选了2400个克隆在爪蟾早期胚胎中的表达,其中624个克隆在胚胎发育的时间或空间上显示差异表达,序列同源性分析表明,在这些差异表达的克隆中有未知基因,结构蛋白,还有一些发育调控因子,如转录因子,信号分子及受体.
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