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目的：1.通过网络数据库技术构建非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂(NNRTIS)数据库,作为虚拟筛选参考分子库,其中包括香豆素类天然产物。2.通过分子对接技术对SPECS数据库(含16062个天然产物)、SYSU数据库、中药化学成分数据库(TCM Bank)与NNRTIS数据库共240950个化合物分子进行虚拟筛选。3.通过体外抗HIV-1活性检测方法检测25个候选化合物分子的生物活性,验证虚拟筛选方法的预测能力。方法：本文主要通过以下方法筛选研究非核苷类抗HIV-1逆转录酶活性化合物：1.基于数据库资源与数据挖掘,利用网络数据库技术建立非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂(NNRTIS)数据库,用于存储、查询化合物和靶标结构信息,作为虚拟筛选的参考分子库。数据库的构建主要应用目前比较流行的LAMP网站架构,包括Linux操作系统,Apache HTTP服务器,MySQL数据库和PHP脚本语言。2.利用SPECS数据库(含16062个天然产物)、SYSU数据库、中药化学成分数据库(TCM Bank)与NNRTIS数据库构建虚拟分子库,作为虚拟筛选的候选分子库。3.利用RCSB PDB (Protein Data Bank)蛋白数据库资源,使用MOE、SYBYL、 Schrodinger、Discovery Studio四大药物设计软件的分子对接模块进行HIV-1逆转录酶晶体结构的自身对接,根据对接构象、晶体结构分辨率、配体结构特点,为虚拟筛选选择合适的蛋白晶体结构。4.基于分子对接技术与DUD(A Directory of Useful Decoys)数据库资源,使用四大药物设计软件的分子对接模块将43个非核苷类抗HIV-1逆转录酶配体与430个结构相似的非活性化合物分别对接到HIV-1逆转录酶晶体结构的结合口袋,根据对接打分建立ROC曲线模型,选用合适的分子对接模块作为虚拟筛选的方法。5.使用MOE软件对候选分子库分子进行能量优化得到分子低能构象,使用WEGA分子三维相似性程序将分子低能构象与晶体结构配体进行三维相似性叠合得到分子叠合构象,使用Discovery Studio软件对每个分子的低能构象和叠合构象分别进行构象搜索,将搜索到的构象作为虚拟筛选的分子构象。6.利用合适的分子对接模块将候选分子的分子构象对接到HIV-1逆转录酶晶体结构的结合口袋,统计分析对接结果,选择打分较高和结合模式较优的化合物作为生物活性测试的候选分子。7.采用国际通用实验方法对候选分子进行体外抗HIV-1活性检测,得到每个化合物抑制HIV-IIIB病毒感染的C8166淋巴细胞合胞体形成50%时的浓度(EC50),对50%正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的浓度(CC50),治疗指数TI(EC50/CC50)。结果：1.采用网络数据库技术,利用LAMP网站架构成功构建了非核苷类HIV-1逆转录抑制剂(NNRTIS)数据库,数据库存储1340个化合物和205个靶标结构信息,同时实现了化合物名称、化合物SMILE格式描述符、靶标名称和靶标PDB ID四种检索方式。2.构建的候选分子库共有240950个小分子化合物,其中包括SPECS数据库小分子化合物201762个,SYSU数据库化合物7097个,TCM Bank数据库小分子30751个,NNRTIS数据库小分子1340个。3.通过对HIV-1逆转录酶晶体结构的分析和自身对接,选择参与虚拟筛选的蛋白晶体结构PDB ID为2ZD1。4.将DUD数据库的473个小分子进行分子对接,并建立了ROC曲线模型,根据AUC面积大小选择Schrodinger药物设计软件Glide SP对接模块作为虚拟筛选方法。5.使用MOE软件为每个小分子生成低能构象,应用WEGA软件包为每个小分子生成叠合构象,使用Discovery Studio软件为每个低能构象和叠合构象分别生成10个构象,最后每个分子得到20个构象。6.通过Glide SP对接模块成功将240950个化合物的分子构象对接到HIV-1逆转录酶晶体结构2ZD1的结合口袋,分析虚拟筛选结果,最后选择25个具有化学结构代表性的化合物进行体外抗HIV-1生物活性测试。7.虚拟筛选结果显示240950个化合物分子中,抑制剂与未知活性分子打分分布曲线明显分离,打分均值分别为-9和-7,而对接打分大于11.0的165个化合物分子中,抑制剂与未知活性分子打分分布曲线明显接近,打分均值为-11.32和-11.38,这些结果说明该虚拟筛选方法具有一定的预测能力,打分较高的分子具有抗HIV活性的可能性较大。8.虚拟筛选结果显示对接打分大于11.0的165个化合物分子中,抑制剂分子占到27.20%,抑制剂利匹韦林的打分总排名第2位,中药成分占到6.0%,来自TCM Bank数据库的中草药活性成分Inphyllum P打分总排名98位,文献报道其分子水平抑制HIV-1逆转录酶的活性值ECso为0.13 uM,这些结果都充分验证了该虚拟筛选方法具有一定的可靠性和准确性。9.通过分析对接打分大于11.0的165个化合物分子中45个抑制剂的虚拟筛选结果得出：打分越高,与残基Lys101形成氢键,与残基TYR181,TRP229形成π-π堆积作用,对接构象呈现类马蹄状柔性构象的化合物分子具有逆转录酶抑制活性的可能性越大。10.本文对25个化合物进行体外抗HIV-1生物活性测试,25个化合物分子都具有抗HIV-1活性,其中10个化合物抑制HIV-1ItIB病毒感染的C8166淋巴细胞合胞体形成50%时的浓度即EC50值小于10ug/ml,化合物1-(4-fluorophenyl)-3-[2-(1H-indol-3-y1)ethyl]thiourea与6-[[5-(4-chloroanilino)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]methoxy]-4-methylchromen-2-one的治疗指数(TI)大于10。11.生物活性和虚拟筛选实验结果显示化合物1-(4-fluorophenyl)-3-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]thiourea对50%正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的浓度(CC50)大于100,EC50值为4.54 ug/ml,治疗指数(TI)大于18.35,其对接构象呈U形,与晶体结构中内嵌配体非常接近,与HIV-1逆转录酶结合口袋重要残基Lys101形成氢键,与保守残基Trp229和芳香残基Tyr181分别形成π-π堆积作用。化合物6-[[5-(4-chloroanilino)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]methoxy]-4-methylchromen-2-one的CC5o值大于100,EC50值为9.85 ug/ml,TI值大于10.15,其对接构象呈类马蹄状,与残基Lys101、Lys103形成氢键,与残基Trp229、Tyrl81形成π-π堆积作用。生物活性测试结果与虚拟筛选结果相吻合,充分证明了虚拟筛选方法的可靠性。结论：1.从化合物结构考虑,U形、类马蹄形柔性结构的非核苷类逆转录酶抑制剂能通过调整自身结构更好的适应HIV-1逆转录酶结合口袋的变化,对抑制HIV-1逆转录酶活性起到关键作用。2.从逆转录酶残基考虑,抑制剂与HIV-1逆转录酶重要残基Lys101形成氢键,与保守残基Trp229、芳香残基Tyrl81分别形成π-π堆积作用,这样的相互作用模式使得抑制剂与HIV-1逆转录酶的结合更加的稳定,对抑制HIV-1逆转录酶活性起到主要作用。3.从化合物抗HIV活性考虑,25个化合物分子都具有抗HIV-1活性,除了TI大于10的两个化合物之外,其他化合物活性都较弱,这说明本文建立的虚拟筛选方法是高通量筛选方法,具有一定的预测能力和可靠性,可以缩小活性化合物的筛选范围,在准确性上还需要结合分子动力学模拟等方法进行深入的研究。4.从筛选方法考虑,网络数据库、分子模拟与活性实验相结合能快速的进行活性化合物的筛选,为基于结构的非核苷类逆转录酶抑制剂的设计提供新的思路和方法。网络数据库资源为化合物的虚拟筛选提供宝贵的数据资源,网络数据库技术可用于存储、查询结构信息,并为分子模拟构建候选分子库。分子模拟技术可用于化合物与蛋白质相互作用模式的预测,能缩小活性化合物筛选范围。体外抗HIV-1活性检测能快速的验证虚拟筛选方法的可靠性和准确性。