论文部分内容阅读
木素过氧化物酶(Ligninperoxidase，Lip)是一种由黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)分泌的单血红素糖蛋白。利用黄孢原毛平革菌生产木素过氧化物酶受到许多因素的限制。例如：只有在限氮或其他不均衡的培养基中才能分泌木质素过氧化物酶并且酶活性较低。
本论文以黄孢原毛平革菌为出发菌株，研究了LipH8基因在巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)BM中的表达，构建了一株能分泌Lip酶的基因工程菌BM413。
从黄孢原毛平革菌提取RNA，以此RNA为模板，根据GeneBank上已有的黄孢原毛平革菌的木质素过氧化物酶的编码序列，设计一对引物，根据引物的Tm值和GC含量选择适宜的PCR条件，通过RT-PCR技术进行体外扩增，得到了去掉自身信号肽的木质素过氧化物酶基因(LipH8)；将LipH8基因克隆到载体pUC18，获得克隆载体pUC18-LipH8，转化大肠杆菌JM109；经过双酶切电泳检验所得到的基因与报道的木质素过氧化物酶基因片断大小完全一致。将木质素过氧化物酶基因(LipH8)克隆到芽孢杆菌—大肠杆菌穿梭载体pHY300PLK，转入巨大芽孢杆菌中，获得巨大芽孢杆菌质粒pHY300PLK-LipH8；表达质粒pHY300PLK-LipH8经过线性化后，利用巨大芽孢杆菌BM在对数生长后期开始形成的的自然感受态，转入BM中。用BamHI和EcoRI双酶切并电泳检验，木质素过氧化物酶活力测定等方法鉴定，表明去除自身信号肽的黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因(LipH8)在BM中得到了表达。
通过测定对比原巨大芽孢杆菌BM和转入表达质粒pHY300PLK-LipH8的经过基因重组的巨大芽孢杆菌BM413的木质素过氧化物酶活性和几丁质酶活性，可知BM413中木质素过氧化物酶活性比原来菌提高了108％；几丁质酶活性比原巨大芽孢杆菌提高了198％。
巨大芽孢杆菌表达系统在高温等极端环境中有着较强的耐受性和广泛的底物特异性，木质素过氧化物酶基因的成功转入对其在农副产品废弃物的处理和资源化中的应用有着极为重要的意义。