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应用19F-NMR法检测钙离子需要氟代指示剂,5F-BAPTA-AM是应用最广的氟代指示剂,它对钙离子有很高的选择亲和力,并且受细胞内pH值影响很小。另外,用5F-BAPTA检测时,细胞内较高的荧光背景不会对检测结果造成很大的影响。
在合成这种指示剂的过程中,首先利用2,4-二氟硝基苯与氢氧化钾J在45℃反应合成了原料5-氟-2-硝基酚,并用乙酰溴与多聚甲醛(摩尔比l:1)反应合成了乙酸溴甲酯;等摩尔的5-氟-2-硝基酚与氢氧化钠在无水甲醇内反应得到对应的钠盐;该钠盐与过量的1,2一二溴乙烷在162℃反应得到1,2-二(5-氟-2-硝基苯氧基)乙烷;该产物可通过铁粉还原或氢化还原两种途径还原,氢化还原高效快捷,但对设备要求较高;还原产物与过量的溴乙酸甲酯(摩尔比1:6)在氦气环境下反应,反应温度91℃,产物用柱色谱分离后用95%乙醇重结晶;重结晶产物在无水甲醇内与等量的氢氧化钾,回流反应完成后提纯;在氮气环境下,5F-BAPTA钾盐与过量乙酸溴甲酯(摩尔比1:5)在无水乙腈中反应,反应温度91℃,产物用柱色谱分离后在无水甲醇中加热完全溶解,在-4℃冷冻室内析出无色粒状结晶,即5F-BAPTA-AM。利用高效液相色谱HPLC检测了产物纯度,并利用质谱、紫外光谱、核磁氢谱等检测手段鉴定原料5-氟-2-硝基酚和最终产物5F-BAPTA-AM结构,并与文献中资料进行对照,确定了两种化合物的结构,为了确定实验过程的正确性,还对部分过程产物进行了质谱检测,并进行了分析,证明了反应过程的正确性和可行性。
氟代指示剂5F-BAPTA-AM的合成成功为利用19F-NMR法检测生物细胞内游离钙离子奠定了基础,同时也为合成其同类型指示剂积累了经验。