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喹烯酮(quinocetone,QCT)是中国农业科学研究院兰州畜牧与兽药研究所研制的一类新兽药。由于其具有良好的抗菌、止泻和促生长作用,因此,自2003年以来在我国被广泛应用于畜禽和水产养殖业中。QCT属于喹噁啉类药物。同类药物中的卡巴氧和喹乙醇等已被证实具有遗传毒性,因此在多国相继被禁止使用。QCT与它们具有相同的母核结构,先前研究表明QCT在体内外显示出一定的细胞毒性、基因毒性、肝毒性、肾毒性和免疫毒性。本实验室前期研究表明QCT能诱导细胞发生线粒体凋亡,但其分子机制尚不明确。因此,本文旨在以HepG2细胞为模型,探究QCT诱导细胞发生线粒体凋亡的可能分子机制,为评估QCT用药对动物和人的安全性提供实验依据。为了探讨VDAC1/2多聚体在QCT诱导细胞线粒体凋亡中的作用。本研究采用VDAC抑制剂DIDS检测其对QCT诱导的细胞线粒体凋亡的影响。结果发现,与对照组相比,QCT使细胞增殖率下降至34.1%;当加入DIDS后,QCT诱导的细胞增殖率上升到68.5%。同时,QCT使细胞凋亡率上升至34%,当加入DIDS后,QCT诱导的细胞凋亡率下降到9.8%。DIDS还可明显抑制 QCT 诱导的 cleaved-caspase-3,cleaved-caspase-9,cleaved-PARP,胞浆细胞色素 C(CytC)表达水平的上升以及线粒体膜电位(MMP)的下降。为了进一步探究VDAC1/2在QCT诱导的细胞线粒体凋亡中的作用机制,本研究检测了 QCT对VDAC1/2多聚体形成的影响,结果发现QCT促进VDAC1/2多聚体的形成;过表达VDAC1/2后加剧QCT诱导的VDAC1/2多聚体的形成和胞浆Cyt C的释放;而DIDS则明显抑制QCT诱导的VDAC1/2多聚体的形成。以上结果表明,QCT诱导VDAC1/2形成多聚通道,促进CytC释放,进而使细胞发生线粒体凋亡。为了探讨Bak1在QCT诱导的细胞线粒体凋亡中的作用。本研究首先检测了 QCT对Bak1蛋白表达的影响,结果发现,QCT促使Bak1蛋白表达量上升。过表达Bak1后进一步促进QCT诱导的细胞线粒体凋亡;干扰Bak1后则抑制QCT诱导的细胞线粒体凋亡。为了进一步探究Bak1在QCT诱导细胞线粒体凋亡中的作用机制,本研究检测了 QCT对Bak1多聚体表达的影响,发现QCT促进Bak1形成二聚体、三聚体和多聚体;过表达Bak1则加剧QCT诱导的Bak1多聚体的形成。以上结果提示QCT诱导Bak1形成多聚通道,进而促使细胞发生线粒体凋亡。为了探讨Wnt/β-catenin信号通路在QCT诱导细胞线粒体凋亡中的作用。本研究首先检测了QCT对Wnt/β-catenin信号通路的影响,结果发现QCT抑制该信号通路。接着加入Wnt/β-catenin信号通路激动剂氯化锂(LiCl),发现LiCl明显恢复QCT对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用以及QCT诱导的细胞线粒体凋亡。然后检测了 QCT对β-cateninmRNA表达水平的影响,结果发现QCT促进β-catenin mRNA表达量的上升。最后采用蛋白酶体抑制剂MG132检测其对QCT诱导的β-catenin蛋白表达水平的影响,结果表明MG132部分恢复QCT诱导的β-catenin蛋白表达量的下降。以上结果表明QCT抑制Wnt/β-catenin信号通路,进而引起细胞线粒体凋亡,并且QCT通过蛋白酶体这一途径来降解β-catenin蛋白。本研究还探讨了 QCT诱导产生的ROS对VDAC1/2、Bak1多聚体形成的影响以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果表明,ROS清除剂NAC明显抑制QCT诱导的VDAC1/2以及Bak1多聚体的形成,并明显恢复QCT对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用。以上结果表明,QCT诱导产生的ROS参与调节VDAC1/2和Bak1多聚体的形成以及Wnt/β-catenin信号通路的抑制。最后,本研究探讨了 VDAC1、Bak1和β-catenin这三者在QCT诱导细胞线粒体凋亡中可能存在的上下游关系。首先在293T细胞中建立过表达Bak1导致的细胞线粒体凋亡模型,检测Bak1对β-catenin信号通路的影响,结果发现过表达Bak1抑制β-catenin信号通路。然后检测了 VDAC抑制剂DIDS对Bak1蛋白表达水平及其诱导的细胞线粒体凋亡的影响,结果发现DIDS完全抑制Bak1蛋白的表达以及过表达Bak1引起的β-catenin信号通路的抑制作用和细胞线粒体凋亡。最后,在HepG2细胞中验证QCT诱导的细胞凋亡中VDAC1、Bak1和β-catenin三者的关系,结果发现VDAC1和Bak1明显恢复QCT对β-catenin蛋白表达的抑制作用,而过表达β-catenin则对VDAC1和Bak1多聚体的形成无影响。以上试验结果提示在QCT诱导的细胞线粒体凋亡过程中,VDAC1和Bak1可能位于β-catenin的上游。综上所述,QCT诱导HepG2细胞发生线粒体凋亡的信号通路可能是:QCT代谢过程中产生的ROS促进VDAC1/2和Bak1多聚体的形成,同时抑制Wnt/β-catenin信号通路,进而引起细胞发生线粒体凋亡。在QCT诱导的细胞线粒体凋亡中,VDAC1和Bak1可能位于β-catenin的上游。