研究背景乳腺癌是全世界妇女最常见的恶性肿瘤之一,在我国,乳腺癌的发病率也在逐年上升。肿瘤和抑郁相关性的长期随访研究证实二者共病例比较高。由于乳腺位置的特殊性,使得乳腺癌并发抑郁障碍的发生率尤为突出,国内外研究显示乳腺癌病人中抑郁的症状呈现率大约在10-30%,抑郁障碍会严重影响患者的依从性、降低其生活质量及预后、甚至影响化疗药物的药代动力学从而影响药物的治疗效果。因此临床对乳腺癌伴发抑郁症的患者在化疗同时进行抗抑郁治疗。氟西汀便是其中之一,临床研究显示,接受氟西汀治疗的患者其抑郁症状明显得到缓解、生活质量明显提高。肿瘤化疗失败最主要的一个原因就是存在多药耐药(multidrug resistanceMDR)。多药耐药性是指抗某种细胞毒药的耐药细胞对许多结构上无关和作用机制上不同的其他细胞毒药物产生交叉耐药。肿瘤MDR形成涉及以下四大机制：一、药物转运：药物转运蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein P-gp)及其编码基因MDR1基因,P-gp是研究的最多也是MDR形成最主要的蛋白；二、药物代谢：谷胱甘肽S转移酶(glutathione S epoxide transferase GST),其中GST同工酶π(GST-π)与肿瘤耐药及疾病进展密切相关；三、细胞凋亡基因：对那些通过诱导凋亡来杀伤肿瘤细胞的抗肿瘤药物,细胞凋亡基因的调控也与MDR发生息息相关,这其中就包括正向调控基因p53和负向调控基因Bcl-2；四、药物靶：拓扑异构酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ,topo Ⅱ),topo Ⅱ的定量或定性改变均影响药物疗效,这种类型的耐药称为不典型MDR。乳腺癌的多药耐药在临床上也十分常见,逆转乳腺癌化疗的多药耐药问题是乳腺癌治疗中亟待解决的问题。近年来对肿瘤化疗MDR逆转剂的研究越来越多,寻找低毒高效的逆转剂是研究的目标。以往的三代MDR逆转剂由于不良反应严重、溶解性差以及达到逆转耐药效果所需剂量大等原因而在临床应用受限。近年来有研究发现新型抗抑郁药氟西汀(Fluoxetine, FLX)可逆转肿瘤细胞的多药耐药,有望成为第四代肿瘤化疗的增敏剂或MDR逆转剂。目前,乳腺癌化疗方案中合用氟西汀已成为常规。但这种临床合并用药的药理基础尚无系统研究。本课题将研究常用的乳腺癌化疗药物阿霉素(AdriamycinADM)、紫杉醇(Paclitaxel PTX)与合用氟西汀后对乳腺癌细胞的药理作用及机制,为临床乳腺癌化疗药物合并氟西汀的临床应用提供药理学依据。本研究拟从两方面探讨氟西汀对乳腺癌细胞的增敏或逆转耐药作用。一方面我们从氟西汀诱导凋亡这一设想出发,研究联合氟西汀前后细胞凋亡的变化,以及凋亡相关基因抑癌基因p53、抑凋亡基因Bcl-2的表达有无差异。另一方面,直接研究多药耐药P-gp基因和蛋白的表达以及GST-π的表达,探讨氟西汀联合使用前后P-gp及GST-π的表达有无改变；从而阐明氟西汀逆转乳腺癌多药耐药的分子机制。研究目的1细胞水平检测化疗药物单独使用以及合并使用氟西汀对人乳腺癌细胞敏感株MCF-7及耐药株细胞MCF-7/ADM的细胞毒性作用。2流式细胞术检测氟西汀联合使用前后对细胞凋亡的影响。3在分子水平对p53、Bcl-2、P-gp、GST-π蛋白以及MDR1mRNA表达进行检测,探讨氟西汀逆转乳腺癌多药耐药的分子机制。实验方法1MTT法检测氟西汀联合用药前后对细胞增殖抑制的影响倍比稀释氟西汀母液至80、40、20、10、5、2.5μg/ml的工作浓度；同样的稀释阿霉素至80、40、20、10、5、2.5μg/ml和4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml；紫杉醇至16、8、4、2、1、0.5μg/ml。进行MTT实验,加药72h后检测细胞增殖抑制率,细胞增殖抑制率小于10%范围内选择氟西汀的适宜浓度作为联合用药浓度,紫杉醇和阿霉素的用药浓度不变再次进行MTT实验。计算阿霉素、紫杉醇联合氟西汀前后的IC50值,得出氟西汀的逆转倍数。t检验比较联合用药前后IC50值及阿霉素、紫杉醇单独作用MCF-7/ADM和MCF-7两细胞IC50值的差异显著性。2流式细胞术检测氟西汀联合用药前后对细胞凋亡的影响根据MTT实验结果以IC50值为参考,分别选择低、高两浓度作为后续联合用药的药物浓度：1,4μg/ml作为紫杉醇联合氟西汀作用MCF-7/ADM和MCF-7细胞的两个梯度浓度；5,20μg/ml作为阿霉素作用MCF-7/ADM的联合用药浓度；0.5,2μg/ml作为阿霉素作用MCF-7的联合用药浓度。氟西汀联合用药浓度固定为5μg/ml。两细胞经10个药物处理组:control、PTX(l)、PTX(h)、FLX-PTX(l)、 FLX-PTX(h)、ADM(l)、ADM(h)、FLX-ADM(l)、FLX-ADM(h)、FLX处理24h后,Annexin Ⅴ-PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率。采用one-way ANOVA统计方法,并根据方差齐性与否采用Dunnett或Dunnett’s T3检验法进行组间多重比较,比较各单独用药组凋亡率与空白组水平差异显著性,以及t检验比较各联合用药组与对应的单独用药组之间凋亡率表达水平差异显著性。3Western blot法从蛋白水平,RT-PCR和qRT-PCR从基因水平进行氟西汀作用的机制研究各药物处理组(同上)作用两细胞72h后,提取总蛋白用免疫蛋白印迹(Western blot)方法从分子水平检测凋亡相关蛋白p53、Bcl-2蛋白,多药耐药蛋白P-gp、GST-π的表达情况。多药耐药基因MDR1mRNA的表达检测则是两细胞经各组药物处理48h后,提取细胞总RNA进行半定量RT-PCR (semi-quantitative RT-PCR)和实时定量PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)实验。对所有组的目的蛋白及nRNA表达量以内参表达量进行上样量标准化后,以control组作为对照进行归一,采用(?)ne-way ANOVA统计方法,并根据方差齐性与否采用Dunnett或可信区间检验法比较各单独用药组蛋白和mRNA表达与空白组水平差异显著性,以及t检验比较各联合用药组与对应的单独用药组之间蛋白和nRNA表达水平差异显著性。结果1MTT实验检测氟西汀联合用药前后对细胞活力的影响MTT实验结果表明氟西汀作用MCF-7/ADM和MCF-7细胞的IC50值分别是25.34±1.3μg/ml和17.56±0.98μg/ml,5μg/ml浓度下MCF-7/ADM和MCF-7细胞的增值抑制率分别是5.43±2.33%和7.53±0.98%,因此选择5μg/ml作为氟西汀无细胞毒性的联合用药浓度。阿霉素联合氟西汀作用MCF-7/ADM细胞前后IC50值分别是13.62±1.44μg/ml,2.71±0.42μg/ml(P<0.001),差异有统计学意义。逆转倍数RF为5.03。阿霉素联合氟西汀作用MCF-7细胞前后IC50值分别是0.53±0.12μg/ml和0.45±0.04μg/ml,无显著性差异(P=0.338)。阿霉素单独作用耐药株和敏感株的IC50值相差25.7倍(P<0.001)。MCF-7/ADM细胞中紫杉醇联合用药前后的IC50分别是3.30±0.12μg/ml和2.59±0.11μg/ml(P=0.002)。而MCF-7细胞中分别是2.11±0.37μg/ml和1.22±0.16μg/ml(P=0.019),差异均具统计学意义。紫杉醇单独作用耐药株和敏感株的IC50值统计结果具有显著性差异(P=0.006)。2氟西汀增强阿霉素、紫杉醇凋亡诱导作用流式细胞仪检测经药物处理24h后的细胞凋亡结果显示MCF-7/ADM细胞中各组间凋亡率有显著性差异(F=312.564,P<0.001)。多重比较显示与空白组相比,FLX(P=0.161)、ADM(1)(P=0.061)、FLX-ADM(1)(P=0.058)三组凋亡率无显著差异；其余各组凋亡率均显著提高(P<0.05),凋亡率的提高呈剂量依赖性。t-检验联合氟西汀前后各组凋亡率差异结果显示：与单独用药相比,联合用药各组凋亡率均有所上升,差异有统计学意义,FLX-PTX(1)组(P=0.001)、FLX-PTX(h)组(P=0.000)、FLX-ADM(1)组(P=0.020)、FXL-ADM(h)组(P=0.025)。MCF-7细胞中各组间凋亡率具有显著性差异(F=1095.432,P<0.001)：多重比较显示与空白组相比,除氟西汀单独用药组外,其他各处理组凋亡率均显著提高(均P<0.05)。联合氟西汀前后各组凋亡率差异显示：FLX-PTX(1)组(P=0.002)、FLX-ADM(1)组(P=0.008)、FLX-PTX(h)组(P=0.007)、FLX-ADM(h)组(P=0.020)与其对应的单独用药组相比凋亡率均有提高。3Western blot检测两细胞中p53、Bcl-2、P-gp、GST-Tπ蛋白表达3.1两细胞中p53蛋白表达MCF-7/ADM细胞中,One-way ANOVA统计学方法分析显示组间蛋白表达具有显著性差异(F=792.490,P<0.001),与空白组相比,除氟西汀单独作用组外(P=0.953),其余各药物处理组p53蛋白表达均有上升,且呈剂量依赖性(均P<0.001)。与阿霉素、紫杉醇单独作用相比,氟西汀联合用药显著上调p53的表达水平,各组均具统计学意义(均P<0.05)。MCF-7细胞中,One-way ANOVA分析各组p53表达具有显著性差异(F=272.446,P<0.001)。与空白组相比,各药物处理组p53蛋白表达均显著上升,且呈剂量依赖性。与耐药株相似,与对应的单独作用相比,联合氟西汀后显著上调p53的表达水平,且上调效果更为明显。与阿霉素、紫杉醇高浓度单独用药相比,分别8倍和14倍的上调p53水平(均P<0.05)。3.2两细胞中Bcl-2蛋白表达MCF-7/ADM细胞十个药物处理组间Bcl-2蛋白表达统计有显著性差异(F=57.169,P<0.001)。与空白组相比,氟西汀单独作用Bcl-2蛋白表达无统计学差异。阿霉素、紫杉醇单独作用MCF-7/ADM细胞并没有出现预期的下调Bcl-2表达,反而有所上调,这种现象紫杉醇低高两组尤为突出,蛋白表达的上升均具统计学意义。但氟西汀逆转了这一现象,使得各联合用药组Bcl-2相对表达水平均下降到空白组以下,差异均具统计学意义(均P<0.05)。MCF-7细胞各药物处理组间Bcl-2蛋白表达有统计学差异(F=569.921,P<0.001)。该细胞株中空白组仍检测到Bcl-2蛋白的表达,氟西汀单独作用对其无影响。与MCF-7/ADM细胞不同的是,紫杉醇单独作用MCF-7细胞两组下调Bcl-2的表达至空白组的77%和38.8%,阿霉素引起的下调较小,分别至空白组的85.6%和72.3%。联合氟西汀后,Bcl-2的下调更为显著,阿霉素和紫杉醇的联合用药组相对表达量均分别降到空白组的60%和30%以下,差异有显著性(均P<0.05)；与其单独用药组相比,差异有显著性,(均P<0.05)。3.3两细胞中P-gp蛋白表达MCF-7/ADM细胞中,各药物处理组间P-gp的表达具统计学差异(F=96.914,P<0.001)。可信区间检验结果发现与空白组相比,无论单用阿霉素还是阿霉素联合应用氟西汀,P-gp表达均无显著性变化。而紫杉醇单独作用使P-gp水平高达空白组的3.6倍,但联合氟西汀后却下调至空白组的30%以下。MCF-7细胞中各药物处理组间P-gp的表达也具统计学差异(F=146.396,P<0.001)。与空白组相比,阿霉素单用或联合应用组蛋白表达情况与MCF-7/ADM细胞相似；紫杉醇联合氟西汀组与其单独作用组相比虽蛋白表达下调有统计学差异,但相对空白组的表达量差异不大。3.4两细胞中GST-π蛋白表达MCF-7/ADM细胞空白组检测到GST-Tπ的表达,氟西汀单独作用对其表达无影响(P>0.05)；其余各药物处理组均引起GST-π的表达下调(均P<0.05),而与对应的单独用药相比,氟西汀联合用药组GST-π表达水平均下降,差异有统计学意义(均P<0.05)。MCF-7细胞各组均未检测到GST-Tπ的表达。4两细胞中MDR1基因表达经one-way ANOVA统计分析,MCF-7/ADM各药物处理组间差异有显著性(F=9.404,P<0.01),经可信区间检验显示与空白组相比,除FLX组外各单独用药组MDR1表达均呈上调态势,差异有统计学意义。氟西汀联合紫杉醇诱导MDR1基因表达的下调,与其对应单独用药相比差异有显著性(P=0.005,P<0.001),但与Western blot结果不同的是,氟西汀联合阿霉素反而引起MDR1基因表达上调,FLX-ADM(1)组上调明显,差异具统计学意义(P=0.030)。MCF-7细胞中未检测到MDR1基因的表达。qRT-PCR结果同样证实了这一点：以MCF-7细胞的control组为参比,MCF-7/ADM细胞中MDR1相对表达量是其的200倍以上,由此可见MCF-7细胞中MDR1表达可忽略。而MCF-7/ADM细胞中MDR1的相对表达量呈上升趋势,FLX-ADM((?))相对表达量是ADM(1)组的2倍,control组的近5倍,差异均具统计学意义(均P<0.05)。结论1无细胞毒性水平的氟西汀与阿霉素、紫杉醇联合应用对MCF-7/ADM和MCF-7细胞增殖抑制及凋亡诱导具有协同作用,可作为潜在的化疗增敏剂。2氟西汀增敏机制是通过直接和/或间接的作用于药物排流泵P-gp,抑制P-gp、GST-π、Bcl-2蛋白表达,诱导p53蛋白表达。