脊柱黄韧带骨化（ossification of ligamentum flavum,OLF）是导致椎管狭窄,以及脊髓、神经根压迫的重要因素之一,临床多发于下胸椎或胸腰段。OLF诱发因素众多,但其具体发生机制仍不明朗。黄韧带组织主要由成纤维细胞构成,细胞中胶原蛋白增多是OLF的初期病理改变,而Ⅰ型胶原蛋白（collagen protein type I,COL1）表达上调在此起重要作用。基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）可抑制基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）对COL1的降解作用,从而促进OLF发生和进展。Rab蛋白主要参与人体各细胞器间的蛋白运输,文献报道Rab37可增加TIMP-1的胞吐,通过TIMP-1—MMP-9通路抑制肺癌细胞的转移。本组前期实验证实Rab L3在OLF患者成纤维细胞中表达显著增强,因此Rab L3可能为OLF发生过程中的重要因子,且很可能通过调节TIMP-1、COL1表达起作用。目前OLF的机制研究大多依赖体外细胞实验,而动物模型作为体内研究的重要工具,却鲜有报道。文献报道OLF动物模型主要通过将骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）等生物因子及载体植入到黄韧带表面来建立,该方法科学有效,可很好地聚焦OLF过程中的某个阶段。张力刺激是黄韧带退变、肥厚和骨化的重要使动因素,而通过张力刺激诱导OLF的动物模型尚未见报道。本课题拟通过自制应力装置诱发大鼠黄韧带的循环张力刺激,继而诱导OLF,并进行相关实验验证;同时利用该动物模型和体内实验,初步探究Rab L3、TIMP-1和COL1在OLF发生发展过程中的表达变化及分子机制。实验第一部分:大鼠胸腰椎黄韧带的张力刺激诱发方法及其安全性测试目的:研究和制作能够使大鼠胸腰椎黄韧带产生循环张力刺激的方法和应力装置,测试其神经功能安全性,确立最佳张力刺激频率,并验证胸腹脏器安全性。方法:自主研发制作大鼠胸腰椎屈曲应力装置,通过该装置引发大鼠胸腰椎的周期性屈曲动作,自然营造该处黄韧带的循环张力刺激。将9只SD大鼠随机平均分为3组,分别进行60次/分、90次/分和120次/分频率的张力刺激,每日刺激20分钟,最长刺激12周（5天/周）。每周张力刺激结束后,通过BBB运动评定量表评估大鼠肢体运动功能改变（正常为21分）,评价胸腰椎屈曲法诱发黄韧带张力刺激的安全性;12周后选择不引发大鼠BBB运动评分下降的最大频率为最佳张力刺激频率。通过解剖最佳张力刺激诱导12周的大鼠,验证其有无胸腹脏器的损伤。结果:张力刺激12周后,60次/分组和90次/分组大鼠均未发生肢体运动功能障碍,BBB评分均为21分;120次/分组3只大鼠分别于第5周、第12周和第7周出现不同程度运动功能障碍,分别为11分,16分和15分。以90次/分频率张力刺激12周,解剖未见胸腹部重要脏器损伤。结论:大鼠胸腰椎屈曲法及其应力装置可有效诱发黄韧带的循环张力刺激,其最佳张力刺激频率为90次/分,具有良好的神经功能和胸腹脏器安全性。实验第二部分:循环张力刺激诱导大鼠OLF模型的制作及实验验证目的:利用胸腰椎屈曲法制造大鼠黄韧带的循环张力刺激,诱导其胸腰椎黄韧带骨化,建立大鼠OLF模型,并进行实验验证。方法:SD大鼠40只,平均分为5组,每组8只:空白组不予麻醉和张力刺激;麻醉组行腹腔麻醉（1次/日,5日/周）12周,不予张力刺激;其余3组分别予张力刺激4周、8周和12周。张力刺激诱发频率为90次/分,每天20分钟,每周5天（工作日）。借助western blot和RT-PCR技术检测5组大鼠胸腰椎黄韧带组织CD44、BMP-2、Integrinβ3、COL1、OPN、RUNX-2和VEGF等成骨相关分子的蛋白和m RNA表达;通过Micro CT扫描、重建和骨化物测量,以及病理染色技术（HE染色,甲苯胺蓝染色）,观察胸腰椎脊柱标本OLF的发生情况。结果:3个实验组大鼠胸腰椎黄韧带成骨相关分子的蛋白及m RNA表达明显高于2个对照组;RUNX-2的蛋白表达呈现12周组>8周组>4周组趋势,m RNA表达上调在12周组最显著。根据Micro CT扫描和重建结果,4周组和8周组均为单节段OLF,12周组最多出现连续三节段OLF;4周组、8周组和12周组CT横断面骨化物的最大占位面积依次为:1.42 mm2、5.36 mm2和7.28 mm2。病理染色结果显示8周组和12周组大鼠胸腰椎黄韧带均出现软骨细胞增殖和编织骨形成,12周组编织骨形成更显著;4周组可发现软骨细胞增殖,编织骨形成不明显;空白组和麻醉组无软骨细胞增值和编织骨形成。综上所述,提示OLF诱导结果:12周组>8周组>4周组。结论:通过胸腰椎屈曲法对大鼠黄韧带施加循环的张力刺激可成功诱导OLF,且诱导结果具有时间依赖性,即张力刺激时间越长,OLF征象约显著。实验第三部分:Rab L3分子在OLF发生过程中的表达变化及其作用机制研究目的:通过动物模型体内实验,研究OLF发生过程中Rab L3、TIMP-1和COL1的表达变化,分析Rab L3在OLF发生过程中的调控作用及其可能的分子机制。方法:将32只SD大鼠平均分为4组,每组8只:空白组不予麻醉和张力刺激;麻醉组行腹腔麻醉（1次/日,5日/周）12周,不予张力刺激;其余2组分别进行张力刺激6周和12周。借助western blot、RT-PCR以及免疫组化染色和定量技术检测4组大鼠胸腰椎黄韧带组织Rab L3、TIMP-1和COL1的分子表达。结果:western blot结果提示6周组和12周组大鼠黄韧带Rab L3、TIMP-1和COL1的蛋白表达高于空白组和麻醉组;RT-PCR结果显示大鼠黄韧带Rab L3、TIMP-1和COL1的m RNA相对表达量:6周组>12周组>空白组/麻醉组;免疫组化染色及定量检测结果显示大鼠黄韧带Rab L3、TIMP-1和COL1的免疫组化评分:6周组>12周组>空白组/麻醉组。结论:在张力刺激诱导OLF发生过程中Rab L3分子起重要调控作用,其通过上调TIMP-1表达来抑制MMP-9对COL1的降解作用,从而促进黄韧带组织的退变、肥厚和骨化。