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木聚糖酶(Xylanase)是可以将木聚糖降解为木糖和低聚木糖的一类水解酶。木聚糖酶在食品研发、饲料生产、工业造纸和环境保护等诸多方面都有着十分重要的价值。由于天然存在的木聚糖酶产量不能满足应用需求,越来越多的学者采用分子生物学手段构建木聚糖酶工程菌。但在研究过程中,对于木聚糖酶蛋白的检测,仅仅停留在酶活力的检测水平,缺乏高效且准确的木聚糖酶蛋白定量方法。本研究通过制备木聚糖酶抗体,期望利用该抗体对菌体内木聚糖酶蛋白进行初步定量,并对不同xynB基因拷贝数木聚糖酶酿酒酵母工程菌的基因拷贝数、蛋白表达量以及酶活力之间的关系进行探究。本研究将来源于黑曲霉CICC2462的木聚糖酶xynB基因在大肠杆菌BL21中进行原核表达,以纯化的重组木聚糖酶蛋白为抗原制备多克隆抗体,利用制备的木聚糖酶多克隆抗体对构建的随机多拷贝木聚糖酶xynB基因酿酒酵母工程菌进行木聚糖酶蛋白定量分析,探究xynB基因拷贝数、蛋白表达量以及酶活力之间的关系。以期为酶制剂的生产和酶制剂蛋白的检测及菌种改造提供技术支持。研究结果如下:1、构建了 pET28a-xynB重组表达载体,并在大肠杆菌BL21中原核表达,确定了诱导温度37℃,诱导时间7 h,摇床转速180 r/min,IIPTG终浓度100μ0g/mL时蛋白高效表达,该条件下重组木聚糖酶蛋白的量是原始菌株的12.8倍。2、制备木聚糖酶多克隆抗体,获得效价大于1:10000且能特异性识别木聚糖酶的多克隆抗体。3、构建随机多拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌,获得1、2、3、5、7、8、10和11共8种不同木聚糖酶xynB基因拷贝数的酿酒酵母工程菌阳性转化子。4、木聚糖酶多克隆抗体在多拷贝木聚糖酶酿酒酵母表达系统中,对菌体内及发酵液中木聚糖酶蛋白定量分析,得到木聚糖酶基因拷贝数、木聚糖酶蛋白的表达量和木聚糖酶酶活力之间的关系。即在菌体内,木聚糖酶蛋白的量随着拷贝数的增加而增加;在发酵液中,当木聚糖酶基因拷贝数在1-8拷贝时,酶活力逐渐增大,8拷贝酶活力最高为326 U/mL,当木聚糖酶基因拷贝数大于8时,发酵液中木聚糖酶蛋白的量呈减少趋势,木聚糖酶活力降低,10拷贝时酶活力降为163 U/mL,11拷贝时为159 U/mL,较8拷贝时酶活力降低了 30%。