一、研究背景前列腺癌(Prostate cancer,PCa)在许多西方国家是男性最常见的恶性肿瘤之,在美国和欧洲每年癌症新发病例约有25%为前列腺癌,占男性癌症死因的第二位。在临床上,初诊的前列腺癌患者可以分为局限型和进展型两种,其治疗方法也根据此两种划分类型从保守观察、根治性手术到雄激素剥夺治疗而有所不同。对于不能手术治疗的(进展型)雄激素依赖性(androgen-dependent prostate cancer,ADPC)前列腺癌患者,根治性的放化疗联合雄激素剥夺仍然为推荐的线治疗措施。这种治疗方法对于>80%的此种患者是有效的,但是,大部分患者在两年内都逐渐对雄激素刺激失去依赖性,而转变成为具有更高侵袭、增殖等恶性能力更高的雄激素非依赖性前列腺癌(androgen-independent prostate cancer,AIPC)。旦进入此阶段,几乎任何抗癌的治疗手段都对此种患者疗效甚微。因此,研究前列腺癌细胞如何在去雄激素环境下生存、增殖和侵袭,将为临床上前列腺癌的诊断治疗提供新的策略。近年来,microRNAs的发现和研究为理解基因的表达和功能提供了新的思路。microRNA是种只有大约22个碱基的非编码RNA,其功能主要是结合在mRNA的3端非翻译区(UTR)对转录功能起到负调节作用。但是最近关于microRNA的转录激活作用亦见报道。目前通过生物信息学预测,人体内有将近30%左右的基因受到microRNA的调节,特别是那些处在信号转导通路上的分子更是microRNA的调节靶基因。研究显示microRNA具有调节细胞的分化、增殖、发育和凋亡等各种功能。而且有学者报道,前列腺癌相关的microRNA在雄激素信号转导通路上发挥重要调节作用,提示这种调节方式有可能是前列腺癌进展为雄激素非依赖阶段的重要机制。因此,前列腺癌相关的microRNA有望成为临床前列腺癌诊断、治疗和判断预后的重要分子靶标。本实验室前期通过microRNA芯片筛选出在前列腺癌雄激素依赖和非依赖两种细胞系中差异表达的microRNA,发现miR-663在两种细胞系中差异表达明显,可能在前列腺癌雄激素非依赖转化中发挥重要作用。二、研究目的针对AIPC和ADPC细胞系,进行miRNA芯片筛选,建立前列腺癌雄激素阻断治疗后,两个重要阶段的miRNA表达谱数据库。通过细胞模型,明确miR-663主要参与调控细胞哪些生物学功能。寻找miR-663作用的靶蛋白,探索miR-663作用机制。三、主要研究内容针对ADPC和AIPC的细胞系,筛选差异miRNA,鉴定miRNA表达差异通过RT-PCR方法,鉴定组织样本中miRNA芯片筛选的miRNA表达存在差异并探测差异大小,明确后续工作有研究价值。进行miR-663细胞功能学实验,通过转染人工合成的miR-663的模拟物和反义体,在相应的细胞中过表达或敲除miR-663,检测细胞的增殖、侵袭和分化等功能。通过生物信息学和miRNA数据库,筛选miR-663作用的靶蛋白基因,确定靶基因确切结合区域或位点,经过western blot和RT-PCR实验,进步明确miR-663及其调控的靶基因与疾病的关系。四、结果1、利用RT-PCR检测LNCaP-AI,LNCaP细胞系中miR-663的表达明显升高,达4倍左右。证明miR-663在前列腺癌的雄激素非依赖转化过程中发挥作用。2、组织芯片和原位杂交证实miR-663与前列腺癌的病理级别和临床分期密切相关。3、通过转染人工合成的miR-663可以刺激细胞的分化、增殖和侵袭。4、在靶基因调控上,miR-663可调控包括KCNC4在内的众多雄激素抵抗相关的致癌基因。五、结论1、miR-663在LNCaP-AI中的含量明显高于LNCaP,并对LNCaP及LNCaP-AI细胞转染miR-663模拟物及反义体,进行检测,发现miR-663可以明显提升LNCaP细胞的增殖和侵袭能力。这也在定程度上证明miR-663可以促进晚期前列腺癌的扩散;2、通过对于AIPC和ADPC组织中miR-663的检测发现,,miR-663与前列腺癌Gleason评分和临床分期密切相关;3、并且通过对于其靶基因的寻找发现KCNC4可能是改变LNCaP细胞增殖能力的重要通路。4、因此,miR-663有希望可以做为将来研究前列腺癌进展阶段的重要靶标。并为寻找控制晚期前列腺癌的进展提供治疗的新途径。