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长双歧杆菌BBMN68分离自广西巴马健康长寿老人肠道,具有调节肠道菌群、润肠通便、改善肠道结构、增强机体免疫和延缓衰老等益生功能。本研究利用适应性进化获得BBMN68耐酸突变株BBMN68m;采用全基因组重测序技术,筛选出突变株中决定耐酸特性的突变基因CpsD（编码胞外多糖合成的引导糖基转移酶）,并发现突变株胞外多糖发生变化;对突变基因CpsD所在胞外多糖合成基因簇的功能进行生物信息学预测及验证,提出突变株通过调节胞外多糖合成影响菌株生物膜的形成,进而影响菌株耐酸特性;最后通过生理生化手段证明生物参与菌株耐酸反应。研究结果为双歧杆菌耐受机制提供了新的证据,为耐酸性强的益生菌选育提供了新思路。论文结论如下:（1）利用适应性进化获得双歧杆菌BBMN68耐酸突变株BBMN68m。在pH 2.5的条件下,经过连续50次驯化,获得菌株BBMN68m。在pH2.5条件下处理2h,BBMN68m存活率较BBMN68提高10000倍,耐酸能力稳定遗传1000代以上,且益生功能未丢失。（2）采用全基因组重测序技术,筛选出突变株中决定耐酸特性的突变基因CpsD。使用Hisep2000平台进行全基因组重测序,比对得到16个注释到gene上的SNP（Single nucleotide polymorphisms）。其中有6个基因编码的氨基酸序列发生改变,3突变位点位于功能域,其中BBMN681012编码蛋白是胞外多糖合成的关键酶-引导糖基转移酶（CpsD）3D结构改变。通过酵母表达得到纯化CPSD蛋白,对其酶活进行研究发现野生型葡萄糖基转移酶（40.7±1.3）和甘露糖基转移酶活性（66.9±2.3）比突变型的（分别为35.8±0.6和50.5±1.4）强;而突变型半乳糖基转移酶活性（121.2±3.1）比野生型的（90.9±1.1）强,CpsD氨基酸突变影响了蛋白功能。（3）通过多糖分析发现突变株胞外多糖发生改变。提取BBMN68m的粗多糖EPS（exopolysaccharide）,对多糖进行纯化并分析其组成发现:突变株与野生株的EPS产量分别为191 mg/L和332 mg/L:主要成分分子量分别为5.04×l04 Da和3.02×105 Da;多糖单元分别为→2-α-Glc-1→3-α-Glc-1→[3-β-Man-1]4→和Mb1:→2-α-Glc-1→3-α-Glc-1→[3-β-Man-1]8→。（4）通过生物信息学预测及过表达发现菌株通过调节胞外多糖合成基因表达,调节生物膜的形成。对EPS合成基因簇中基因功能进行预测发现,编码蛋白分别具有多糖重复单元输出、链长决定、聚合和转录调节作用以及降解作用c-di-GMP。通过基因在大肠杆菌中表达发现基因1007,1009及1011的表达影响大肠杆菌生物被膜的形成。（5）通过生理验证及显微观察证明生物被膜参与耐酸反应。BBMN68野生株和突变株的生物被膜是由水、EPS、蛋白、DNA和细菌菌体组成;突变株生物被膜呈现圆丘状结构,野生株生物被膜程现均匀平铺结构耐酸性差,突变株可以通过渗透限制、营养限制、形成胁迫响应和抗性表型菌体提高耐酸性;纤维素酶破坏EPS,破坏生物被膜形成,使菌株耐酸性下降;突变株外源添加中野生株EPS浓度达900 μg/L（终浓度）时,耐酸能力提高10倍。