背景:加味三棱丸(以下简称SLW)是经本团队研究治疗子宫内膜异位症有效的一种中药复方制剂,前期工作进行了该制剂对子宫内膜异位症大鼠的主要药效学试验,本文观察了SLW的毒理作用,并进一步进行了药效学及其相关机制的研究,旨在为将其研制成为中药新药奠定基础。目的:1、毒理研究观察SLW对小鼠一次性口服给药的毒性反应并得出药物对小鼠的半数致死量(LD50);观察SLW对雌性大鼠6个月长期毒性过程中一般行为及身体指标的影响,以及对动物血液学指标、血液生化学指标、脏器系数的影响,找出无毒性反应的剂量及药物毒性靶器官,并观察其病理学变化情况。2、药效学及其机制研究观察SLW对正常大鼠血液雌激素、孕激素水平的影响和对大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴的改变;观察SLW对模型大鼠子宫异位内膜的病理形态学改善作用,及其对异位内膜黏附因子ICAM-1、CD44表达的影响。以探讨SLW抗子宫内膜异位症的疗效及其机制。方法:1、SLW急性毒性观察用改良寇氏(Korbor)法进行实验,确定小鼠给药后D0%(动物全部不死的剂量)和D100%(动物全部死亡的剂量),分别作为正式实验的最低剂量和最高剂量。将此最高、最低剂量换算为常用对数,然后将最高、最低剂量的对数差,按所需要的组数随机分为8个对数等距的剂量组,每组10只小鼠,雌雄各半。给药后至少观察2周,每天观察一次,详细记录每只动物各种毒性反应出现和消失的时间,观察神经系统、呼吸系统、消化系统、生殖系统、皮毛、眼、体重及是否消瘦拒食物等。所有动物包括死亡或处死的动物均进行尸检,尸检异常的器官用10%中性甲醛固定作病理组织学检查。详细、及时的记录中毒和死亡发生的时间、持续的时间、恢复的时间和死亡动物的时间分布。计算LD50(半数致死量)及其95%的可信限,换算人用剂量的范围。2、SLW长期毒性观察取雌性健康大鼠160只,随机分为4组,即溶剂对照组、SLW高剂量组、中剂量组、低剂量组,分别给予SLW:1000mg/kg、500mg/kg、250mg/kg,空白对照组给予等量蒸馏水,每组40只。按以上剂量等容灌胃给药6个月,每周连续给药6天。分别于给药3个月,6个月时末次给药24小时后,活杀动物10只,14只,进行各项指标测试。剩下的继续观察30天作为恢复期,恢复期后处死剩下的动物检测各项指标,与前几批处死大鼠的各项指标比较,进行毒性反应的可逆性和延迟性观察。具体指标包括:外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便、摄食量等一般指标,血液学指标,血液生化指标,系统尸解和组织病理学检查,脏器称重和脏器系数测定,体重测定。3、SLW对血中E2、P水平及垂体和卵巢中ERα蛋白表达的影响取雌性大鼠72只,随机分为对照组、SLW 250 mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg组,每组18只。连续灌胃给药6各月,每周灌胃6天。分别于给药第3月末、6月末、停药后1月处死动物,测定大鼠血液中雌激素(E2)和孕酮(P)的水平,取脑垂体和卵巢,常规石蜡包埋、切片,免疫组化法观察动物垂体和卵巢中雌激素受体(ERα)蛋白的表达情况。4、SLW对子宫内膜异位症大鼠异位移植物和黏附分子表达的影响采用自体移植法建立大鼠子宫内膜异位症模型,以移植物的外观、大小及病理检查为模型成功的依据。除正常对照组外,将造模成功的大鼠随机分为SLW 80mg/kg/d组、240mg/kg/d组、720mg/kg/d组、200mg/kg/d孕三烯酮组、模型对照组,灌胃给药,每天1次,连续4周。4周后结束治疗,观察阴道细胞学涂片后处死大鼠,观察异位内膜生长情况,切取在位子宫与异位子宫内膜,HE染色进行形态学病理检察。免疫组化法检测黏附分子ICAM-1、CD44的表达。结果:1、SLW小鼠口服给药急性毒性SLW口服给药小鼠D0%=2400mg/kg,Dmin(最小致死量)=2600mg/kg,D100%(完全致死量)=9800mg/kg , LD50 = 5414.58mg/kg , LD50的95%的可信限为:5292.34~5536.82 mg/kg。按照文献[15]换算分别相当于人的口服剂量为303.60mg/kg、1239.7mg/kg、694.84mg/kg。动物给药后的毒性症状有:少动、精神萎靡、拒食、爬笼、跳起、呼吸徐缓、困难、潮式呼吸、上眼睑下垂后腿抽搐等。死亡动物尸检,主要脏器肉眼观察无明显的病变,HE染色观察,除肝脏有轻微病变外,其它脏器无明显病理变化,提示SLW对小鼠的急性毒性较轻。2、SLW大鼠口服长期毒性SLW连续给药3个月及6个月,结合血象、生化、脏器系数、病理分析,并与停药1个月后检测动物的各项指标相比, SLW对大鼠的一般行为指标,一般生理指标,血象指标,脏器系数及脏器病理检查均没有明显的影响。表明,加味三棱丸为一种安全性高的中药复方制剂,动物试验得出在1000mg/kg剂量下安全。3、SLW对血中E2、P水平及垂体和卵巢中ERα蛋白表达的影响分别于给药3个月、6个月、及停药1个月后,检测大鼠血中雌激素(E2)和孕酮(P)水平,其结果500mg/kg组、1000mg/kg组大鼠血中E2水平与正常对照组比较,显著升高(P<0.05);500mg/kg组、1000mg/kg组大鼠血中P水平与正常对照组比较,显著降低(P<0.05)。用免疫组化法检测脑垂体和卵巢中雌激素受体(ERα)的蛋白表达,ERα阳性细胞全细胞染色为棕黄色,SLW给药后主要表达于脑垂体的嗜碱性粒细胞,卵巢的各级生长卵泡颗粒及黄体细胞。给药后,SLW 250mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg组ERα阳性细胞表达较对照组明显减少,阳性的棕黄色减轻,且在停药后不能恢复。免疫组化图像分析结果显示,给药后SLW 250 mg/kg、SLW 1000mg/kg组脑垂体和卵巢中ERα阳性细胞累积积分光密度值(IOD值)与溶剂对照组相比减少,有显著性差异,停药1个月后仍不能恢复。4、SLW对子宫内膜异位症大鼠异位移植物和黏附分子表达的影响显微镜下形态显示,给药组与模型组比较其病理改变程度减轻,异位内膜为薄单层细胞排列而非腺体数目多,细胞呈多层排列,腺上皮呈扁平或矮立方形,未见假腺体改变;免疫组化结果SLW 240 mg/kg、720 mg/kg组均能明显降低了异位子宫内膜粘附分子ICAM-1和CD44的蛋白表达。结论:1、小鼠急性毒性试验口服一次性给药LD50为5414.58/kg,相当于动物有效剂量的22.56倍。SLW连续给药180天,结合体重及其增长、血液学、血液生化学、脏器指数、病理结果综合分析,提示改药物对血象、血液生化没有明显的影响,没发现明显的脏器毒性靶点,对动物的一般行为、摄食量及体重无明显影响,毒性反应较轻。总之,SLW的毒性较低,是较为安全的中药复方制剂。2、SLW能显著降低大鼠血中雌激素水平,显著升高孕激素水平,能明显减少雌性大鼠脑垂体及卵巢中雌激素受体(ERα)的蛋白表达,提示其使雌激素减少的机制与SLW对动物下丘脑-垂体-卵巢轴的抑制作用有关。3、SLW能减轻子宫内膜异位症模型大鼠异位内膜的病理变化,其作用机制与减少异位内膜粘附分子ICAM-1和CD44的表达有关。