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背景:目前结直肠癌的发病率在西方国家排名第三位,并且发病率有随着年龄的增长而增加的趋势。据2015年中国癌症统计数据显示,我国结直肠癌发病率、死亡率在所有恶性肿瘤中均位居第5位,约20%患者发生了远处转移,最常见转移的器官是肝脏。目前手术是大部分结直肠癌患者的主要治疗方法,放疗和化疗也是重要的辅助治疗部分。而对于晚期结直肠癌患者,化疗是主要的选择。很多结直肠癌患者,发现症状时病情已属于中晚期,无法手术治疗,缺乏有效的治疗手段。对大肠癌发病机制的认识不足限制了人们的治疗选择。为了能早期预测和诊断肿瘤,人们逐渐认识到了原癌基因和抑癌基因的异常变化在恶性肿瘤发生发展过程中的重要作用,尤其是抑癌基因功能的丧失越来越受到人们的重视。抑癌基因,也叫肿瘤抑制基因,是一类负调控基因。近年来,人类抑癌基因的克隆和鉴定取得了很大的进展。自从1986年分离出视网膜母细胞瘤(retinoblastoma。RB)基因以来,许多人类肿瘤抑制基因被克隆并鉴定。肿瘤抑制基因的突变会极大增加个体的相关肿瘤易感性,而且它们在许多散发性疾病中也被观察到发生了体细胞突变,变成了一种不活跃的形式。考虑到它们在肿瘤发生或发展过程中被灭活,肿瘤抑制基因被认为是编码增殖的负调节因子,或者以其它方式抑制正常功能时肿瘤的发生。随着分子生物学技术的发展,越来越多的抑癌基因被发现。近年来有学者发现CD226的功能突变能增加非吸烟人群的肺癌的易感性,另有研究称CD226在多种肿瘤中被灭活,且CD226高表达的肝癌患者术后的生存率和存活时间均较高。根据以上结果我们推测CD226极有可能是一个新的抑癌因子。CD226是免疫球蛋白超家族成员,属于Ⅰ型跨膜糖蛋白。既往研究表明,CD226在多种疾病中发挥着不同的生物学功能。例如CD226作为黏附分子可促进CTL细胞迁移到炎症感染局部。作为共刺激分子,CD226与CD96、TIGIT等分子协同作用调节NK细胞功能,维持NK细胞在许多自身免疫性疾病中的功能。近年来研究发现CD226分子与多种肿瘤的发生发展相关。但是CD226在恶性肿瘤发生发展中的作用机制仍不清楚,CD226在结直肠癌细胞中的表达及其与临床病理学参数的关系仍不清。鉴于此,我们首先通过查询数据库,发现CD226在多种恶性肿瘤中表达缺失,且CD226高表达的结肠癌患者术后生存率更高,存活时间更长。之后在预实验中运用IHC检测了CD226在结直肠癌患者临床组织标本中的表达,发现CD226高表达的样本肿瘤体积更小,且更不容易发生淋巴结转移。由此我们初步判断CD226与肠癌细胞的增殖、迁移相关。因此,本研究拟通过观察CD226对结直肠癌细胞增殖和侵袭迁移的影响,探讨CD226在结直肠癌发生发展过程中的作用及其机制。目的:通过探究CD226在结直肠癌中的作用及其作用机制,为肿瘤的治疗提供新的思路和靶点。方法:首先查询TCGA数据库,观察CD226在各种肿瘤组织中的表达情况,以及CD226的表达高低是否与患者的存活率和存活时间相关。之后选取2019年2月至2020年2月就诊于中山大学附属第三医院的结直肠癌患者,在取得患者知情同意后,采集患者的临床组织标本共20例,利用q PCR的方法观察CD226在肿瘤组织中的表达情况。收集2017年1月至2018年12月就诊于中国人民解放军联勤保障部队第924医院(原解放军第181医院)的结直肠癌患者肿瘤石蜡组织切片共93例,利用免疫组化的方法探究CD226与临床病理学因子的关联。然后进行细胞实验进一步观察CD226在肠癌细胞株中的作用。收集实验室中已有的五种肠癌细胞株,用q PCR、western blot的方法观察各个细胞系中CD226的表达情况。利用慢病毒载体构建CD226过表达/敲低的稳定细胞株,并通过CCK8、细胞划痕、transwell实验探究CD226对肠癌细胞株增殖、侵袭、转移的作用。用裸鼠皮下成瘤进行动物实验,验证CD226在动物体内仍然发挥对肿瘤细胞增殖的抑制作用。最后通过Western blot方法对CD226抑制肠癌细胞增殖和转移的机制进行初步的探索。结果:1.为了了解CD226在各个肿瘤组织及正常组织中的表达情况以及明确CD226是否与病人的生存时间相关,我们查询了TCGA数据库方式,结果显示CD226在多种恶性肿瘤组织中表达均低于正常组织,且CD226的表达与患者的生存时间和存活率相关。CD226高表达的临床样本生存时间较长,存活率较高;CD226低表达的临床样本生存时间较短,存活率较低。2.进一步明确CD226在人肠癌组织中的表达情况。20例临床样本q PCR结果表明CD226在肠癌组织中的表达低于远癌组织。3.为了探究CD226与临床病理学因子的关联,用免疫组化的方法观察93例肠癌患者临床病理切片中CD226的表达情况。染色结果结合临床资料显示CD226高表达的患者肿瘤体积更小,更不容易发生淋巴结转移。4.细胞实验验证了CD226高表达肠癌细胞株增殖能力和侵袭转移能力减弱,CD226低表达肠癌细胞株增殖能力和侵袭转移能力增强。5.裸鼠皮下成瘤实验结果显示与CD226低表达的细胞形成的肿瘤相比,CD226高表达的细胞形成的肿瘤的体积与重量均较小,验证了CD226的在体内的抑癌作用。6.Western blot实验显示CD226可能通过抑制AKT的磷酸化来发挥其抑癌作用。结论:1.CD226在正常肠上皮组织中高表达,在肠癌组织中低表达,且其表达与肿瘤大小、淋巴结转移密切相关。2.CD226可能通过抑制AKT的磷酸化来发挥抑癌作用。