碱提枣多糖抗凝血作用途径的初步探讨

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本研究采用新郑灰枣为实验原料,利用不同方法对其多糖成分进行提取纯化,进行抗凝血活性分析及抗凝血途径研究,确定其抗凝血活性及作用途径;分离活性较高的碱提多糖,对组分进行组分分析、纯度分析及构象分析,从而推测其产生抗凝血活性的原因。主要内容如下:1、红枣多糖的提取方法对其抗凝血活性存在影响。碱提红枣多糖抗凝效果较好,多糖溶液浓度为10mg/mL时,其对APTT值的延长达到水提红枣多糖的11.1倍。2、乙醇浓度对多糖的组分及抗凝活性影响显著,60%-80%乙醇浓度区间利于高体外抗凝血活性多糖的获得。随乙醇浓度提高,产物抗凝血活性增强;产物抗凝血活性与多糖含量显著正相关,与蛋白含量显著负相关。3、脱蛋白方法中,Sevage法更适用于抗凝血活性多糖的制备,该组APTT较空白延长1.32倍;脱色方法中,活性炭法更适用于抗凝血活性多糖的制备,该组组较空白组延长0.67倍。4、抗凝血途径研究结果表明(1)抗凝血作用对象研究表明,在血小板途径中,血小板数量及凝聚现象未见异常改变:从酶型途径上,多糖对血浆PT值无影响,对APTT值及凝血因子影响显著,表明其对内源性凝血系统有抑制作用;在对纤维蛋白溶解方面,未见显著作用。(2)对碱提红枣多糖进行DEAE-52纤维素层析柱分离,得到四种多糖组分,分别为JPS5-Ⅰ. JPS5-Ⅱ JPS5-Ⅲ和JPS5-Ⅳ;分别进行抗凝血活性研究,其APTT值分别为0、15.100、45.100和181.500。组分Ⅰ和组分Ⅱ表现为促凝活性,组分Ⅲ为弱抗凝血活性,组分Ⅳ为强抗凝血活性。(3)对组分Ⅱ和组分Ⅳ进行Sephacryl S-300凝胶层析和可见-紫外光谱扫描,结果表明组分Ⅱ为均一的、分子大小分布范围较小的、不含色素的具有多糖及蛋白特征吸收的糖蛋白缀合物;组分Ⅳ为均一的、分子大小分布范围较大的、不含色素与蛋白的具有多糖特征吸收的多糖类物质。(4)多糖组分对内源凝血途径影响的研究中,组分Ⅱ对凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ和凝血因子Ⅺ活性的抑制率分别为6.4%、6.8%和4.1%;组分Ⅳ对凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ和凝血因子Ⅺ活性的抑制率分别为39.8%、36.9%和44.3%。组分Ⅱ不能提高凝血因子活性,其促凝作用产生原因有待进一步研究,而组分Ⅳ的抗凝作用可归因于其对凝血因子活性的抑制,属于针对凝血因子的内源性凝血途径。5、对两组分进行单糖组成、部分酸水解、高碘酸氧化及Smith降解后采用气相色谱分析,组分Ⅱ中存在鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖及半乳糖,其主要单糖组成为阿拉伯糖:木糖:半乳糖=10.4:1:1.7;其大部分键在低三氟乙酸浓度下稳定,阿拉伯糖多存在于主链其他糖多存在于支端;多糖中1→3、1→2与1→6糖苷键的比例约为18.85:5.15:1。组分Ⅳ中存在阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖,其主要单糖组成为木糖:葡萄糖:半乳糖=6.7:1.8:1:1.6;具有部分易被低浓度三氟乙酸破坏的键型,阿拉伯糖多存在于主链,甘露糖完全存在于主链,其余糖存在于支端;多糖中1→3、1→2与1→6糖苷键的比例约为5.48:1.09:1。6、p-消除反应结果表明两种组分都会由于稀碱的作用使紫外区吸收增加,表明其都有O-糖苷键的存在;碘-碘化钾反应表明,两种多糖在560nm-600nm范围内无最大吸收,都为无卷曲结构的非淀粉类多糖;刚果红实验结果表明,组分Ⅱ表现出最大吸收波长先增大后减小的特征变化,而组分Ⅳ未发现此种变化,提示组分Ⅱ可能具有有序的三股螺旋结构而组分Ⅳ不具有该结构。
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