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目的通过体外H9c2心肌细胞实验,测定不同锰浓度处理组氧化应激、线粒体损伤、凋亡和自噬相关蛋白的表达情况,探讨金属锰染毒对H9c2心肌细胞的毒性作用。方法（1）采用0,100,200,400μM氯化锰（MnCl2）分别对大鼠H9c2心肌细胞进行染毒24小时后,在倒置相差显微镜下观察细胞形态,应用MTT法检测细胞存活率。（2）采用Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒检测H9c2细胞凋亡率,Western blot检测凋亡蛋白Caspase 3、Bcl-2的相对表达量。（3）采用南京建成试剂盒检测H9c2心肌细胞外液心肌酶谱AST和LDH水平。（4）采用南京建成试剂盒检测H9c2心肌细胞内SOD和CAT水平。采用1mM NAC提前1小时处理H9c2细胞后染锰24小时,染锰剂量同上,MTT法检测细胞存活率。（5）采用DCFH-DA荧光探针检测H9c2心肌细胞内ROS水平,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位水平。（6）Western blot检测不同浓度染锰后,H9c2心肌细胞自噬相关蛋白mTOR、p-mTOR、Atg7、p62、Beclin1、Atg5、Atg3、LC3蛋白的相对表达量。此外,采用50μM的CQ提前2小时处理H9c2细胞后染锰24小时,染毒剂量为200μM,Western blot检测LC3和p62蛋白相对表达量,共聚焦检测LC3和p62蛋白免疫荧光。10 nM的Rapamycin提前1小时处理后,染锰方法同上,Western blot检测mTOR、p-mTOR蛋白相对表达量。结果（1）与对照相比,当染锰浓度≥200μM时,随着染锰浓度的增高,H9c2细胞存活率显著下降（P<0.05）,并可引起H9c2细胞不同程度的损伤和形态学改变。染锰时间≥12h时,随着染锰时间的增加,各组间H9c2细胞存活率出现显著性差异（P<0.05）,细胞存活率下降。（2）随着染锰剂量的增加,H9c2心肌细胞凋亡率增加;各组间凋亡率有显著差异（P<0.05）,对照、低、中、高剂量组凋亡率分别为（4.275±2.103%）、（5.225±2.138%）、（10.175±1.756%）、（16.625±5.847%）。各组间Caspase3蛋白相对表达量无明显差异,但Cleaved-Caspase 3蛋白相对表达量显著增高,400μM剂量组显著高于其他三组（P<0.05）,Bcl-2蛋白相对表达量呈下降趋势,400μM剂量组显著低于对照组（P<0.05）。（3）随着染锰剂量的增加,H9c2细胞外液AST无明显改变,但LDH水平逐渐升高,对照、低、中、高剂量组LDH水平分别为（378.162±19.243）U/L、（393.297±28.602）U/L、（410.378±29.219）U/L、（432.432±24.526）U/L。200μM剂量组和400μM剂量组显著高于对照组（P<0.05,P<0.001）。（4）NAC抗氧化剂+染锰组与仅有染锰组相比,细胞存活率显著提高（P<0.001）;随着染锰剂量的增加,H9c2细胞内SOD水平呈下降趋势,染锰组SOD水平均显著低于对照组（P<0.001）。CAT含量也呈下降趋势,400μM剂量组（2.210±1.601 U/mgprot）显著低于对照组（4.400±0.790U/mgprot）（P<0.05）。（5）随着染锰剂量的增加,H9c2细胞内ROS水平显著升高,200μM和400μM剂量组DCFH-DA荧光强度显著高于对照组（P<0.001）;H9c2细胞线粒体膜电位随着染锰剂量的增加而下降,200μM和400μM剂量组红色/绿色荧光平均强度与对照组相比差异均具有统计学意义（P<0.001）。（6）共聚焦结果显示,对照组LC3和p62蛋白均弥散分布于胞浆中,染锰组有LC3斑点出现。Western blot结果显示,H9c2细胞400μM剂量组mTOR和p-mTOR蛋白相对表达量均显著低于其余各剂量组,差异具有统计学意义（P<0.05）。随着染锰剂量的增加,其中Atg7蛋白相对表达量400μM剂量组显著低于其余各剂量组（P<0.05）,Atg5蛋白相对表达量400μM剂量组显著低于200μM剂量组（P<0.05）,Atg3蛋白相对表达量400μM剂量组显著低于100μM剂量组（P<0.05）;LC3I、LC3II蛋白相对表达量均呈下降趋势,LC3I蛋白相对表达量400μM剂量组显著低于其余各剂量组（P<0.05）,LC3II蛋白相对表达量200μM和400μM剂量组显著低于对照组和100μM剂量组（P<0.05）。各组间LC3II/LC3I的比值无显著性差异（P>0.05）。（7）共聚焦结果显示,与对照组相比,CQ和CQ+Mn处理组LC3蛋白和p62蛋白荧光强度均增高,胞浆内出现明显聚集成斑点状的LC3蛋白和p62蛋白,且CQ+Mn组比CQ组更为明显。Western blot结果显示,CQ+Mn处理组p62蛋白相对表达量显著升高,与对照组比差异具有统计学意义（P<0.05）;CQ和CQ+Mn组LC3II蛋白相对表达量分别与对照和Mn处理组相比均升高,差异均具有统计学意义（P<0.05）,且CQ+Mn处理组LC3II/LC3I比值显著高于对照与Mn处理组（P<0.05）,LC3I蛋白相对表达量在各组间无显著差异（P>0.05）。（8）Rapa处理组和Rapa+Mn处理组mTOR和p-mTOR蛋白相对表达量均降低,与对照和Mn处理组相比差异均具有统计学意义（P<0.05）。对照和Mn处理组之间,Rapa处理组和Rapa+Mn处理组之间无显著差别（P>0.05）。结论（1）MnCl2染毒可导致H9c2心肌细胞形态发生变化,升高细胞凋亡率,降低细胞存活率。（2）MnCl2染毒可导致H9c2细胞LDH水平升高。（3）MnCl2染毒可引起H9c2细胞ROS水平升高,线粒体膜电位降低,抗氧化能力下降,氧化应激水平增高。（4）MnCl2染毒可以抑制mTOR信号通路,启动介导自噬体形成的泛素样接合系统,从而激活自噬。