目的:探讨降钙素基因相关肽（Calcitonin gene related peptide,CGRP）对环状RNA（CircularRNA,circRNA）介导的巨噬细胞内白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）表达的影响。材料与方法:1.细胞和试剂本实验的实验对象为RAW264.7巨噬细胞系,使用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养。换液前使用磷酸盐缓冲液清洗细胞。实验使用的CGRP为α-CGRP。2.CGRP最佳作用浓度和最佳作用时间的筛选实验设定CGRP浓度梯度为0.01nM、0.1nM、1nM、10nM和100nM,分别作用于接种密度相同的巨噬细胞,在设定时间点使用实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-time Quantitative PCR Detecting System,qPCR）来测定IL-6 mRNA的表达;实验设定CGRP时间梯度为1小时、2小时、3小时、4小时和5小时,分别以相同浓度作用于接种密度相同的巨噬细胞,在相应时间后使用qPCR来测定IL-6 mRNA的表达,通过以上两个步骤确定CGRP作用的最佳浓度和时间。3.circRNA芯片的制作和筛选将细胞以相同密度接种培养,用选定浓度的CGRP刺激RAW264.7巨噬细胞选定时间后,充分裂解实验组和空白对照组细胞,收集裂解液、制备样本并交由生物公司做circRNA芯片。根据该公司提供的芯片结果,将发生改变的circRNA按照改变倍数的大小或预测miRNA结合位点的多寡进行筛选,并通过qPCR及其产物测序进行circRNA表达的验证,采用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）定位和证实circRNA,最终确定进一步实验的目标circRNA。4.circRNA对IL-6表达作用的验证1)circRNA的干扰实验将细胞以相同密度接种于6孔板中。选择3种设计好的小干扰RNA（Small interferingRNA,siRNA）以相同浓度分别作用于对应实验组。刺激48小时以后,充分裂解各实验组和空白对照组细胞,使用qPCR检测各组选定circRNA的表达情况,并最终确定进一步实验所使用的siRNA。2)qPCR检测IL-6 mRNA的表达将细胞以相同密度接种于6孔板中。本部分实验分为空白对照组、CGRP组和CGRP+siRNA组。选择上一步干扰效果最好的siRNA预先处理CGRP+siRNA组的细胞48小时,然后使用选定浓度的CGRP刺激CGRP组和CGRP+siRNA组的细胞。刺激选定的最佳刺激时间后,充分裂解各组细胞并使用qPCR检测各组IL-6 mRNA的表达水平。3)Western-blot检测IL-6蛋白的表达将细胞以相同密度接种于6孔板中。本部分实验分为空白对照组、CGRP组和CGRP+siRNA组。选择干扰效果最好的siRNA预先处理CGRP+siRNA组的细胞48小时,然后使用选定浓度的CGRP刺激CGRP组和CGRP+siRNA组的细胞。刺激选定的最佳刺激时间后,充分裂解各组细胞并使用Western-blot检测各组IL-6蛋白的表达水平。5.circRNA对下游小分子RNA（microRNA,miRNA）表达作用的验证1)miRNA的筛选根据circRNA芯片结果,找到选定的circRNA对应的5个目标miRNA。根据生物信息学网站和软件预测其靶基因和参与的炎症通路,找到与IL-6相关的miRNA并进行下一步的验证。2)qPCR验证circRNA对选定miRNA表达水平的影响将细胞以相同密度接种于6孔板中。本部分实验分为空白对照组、CGRP组和CGRP+siRNA组。选择干扰效果最好的siRNA预先处理CGRP+siRNA组的细胞48小时,然后使用选定浓度的CGRP刺激CGRP组和CGRP+siRNA组的细胞。刺激选定的最佳刺激时间后,充分裂解各组细胞并使用qPCR检测各组选定miRNA的表达水平。6.目标miRNA对IL-6表达作用的验证1)qPCR检测IL-6 mRNA的表达将细胞以相同密度接种于6孔板中。本部分实验分为空白对照组、CGRP组、CGRP+mimics组和CGRP+inhibitor组。选择选定miRNA的过表达试剂（mimics）和干扰试剂（inhibitor）预先处理对应组的细胞24小时,然后使用选定浓度的CGRP刺激CGRP+mimics组和CGRP+inhibitor组的细胞。刺激选定的最佳刺激时间后,充分裂解各组细胞并使用qPCR检测各组IL-6 mRNA的表达水平。2)Western-blot检测IL-6蛋白的表达将细胞以相同密度接种于6孔板中。本部分实验分为空白对照组、CGRP组、CGRP+mimics组和CGRP+inhibitor组。选择选定miRNA的过表达试剂（mimics）和干扰试剂（inhibitor）预先处理对应组的细胞24小时,然后使用选定浓度的CGRP刺激CGRP+mimics组和CGRP+inhibitor组的细胞。刺激选定的最佳刺激时间后,充分裂解各组细胞并使用Western-blot检测各组IL-6蛋白的表达水平。7.统计学分析采用SPSS19.0统计软件对数据进行统计分析,各组数据符合正态分布,方差齐,对各组数据进行配对双侧t检验,所有实验均重复4次,结果以均值±标准差（?±s）表示,以双侧P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.细胞培养本实验的培养方法可以获得生长状态稳定良好的RAW264.7巨噬细胞。该细胞刚贴壁时呈圆形,折光度很好,镜下观察如小珍珠状散落于培养器皿底面。贴壁培养一段时间后,细胞会变为多边形,不规则,可见伪足状突起。该结果符合RAW264.7巨噬细胞系的生物学特性。2.CGRP最佳作用浓度和最佳作用时间的筛选当CGRP作用浓度为0.1nM或1nM时,IL-6 mRNA的相对表达水平与对照组的相比具有统计学差异。其中,当CGRP浓度为1nM时,IL-6 mRNA相对表达水平最高。当CGRP作用时间为2小时或3小时时,IL-6 mRNA的相对表达水平与对照组的相比具有统计学差异。其中,当CGRP作用时间为2小时时,IL-6 mRNA相对表达水平最高。3.circRNA芯片的制作和筛选芯片结果表示,相对表达值上调超过2倍的circRNA共有173个,下调超过2倍的circRNA共有179个。将这些circRNA按照改变倍数的大小排序或预测miRNA结合位点的多寡进行筛选后,通过qPCR验证,mmu_circRNA₀07893的改变倍数最稳定,与芯片结果相符,产物测序与circRNA连接位点序列一致。FISH实验证明mmu_circRNA₀07893确实绝大多数存在于细胞质中,与芯片结果一致。4.circRNA对IL-6表达作用的验证1)circRNA的干扰实验3种siRNA对mmu_circRNA₀07893的表达都有显著抑制作用,其中siRNA3对mmu_circRNA₀07893的表达抑制作用最强。2)qPCR检测IL-6 mRNA的表达CGRP组相对于空白对照组,IL-6 mRNA的相对表达值显著升高,CGRP+siRNA组相对于CGRP组,事先用siRNA处理过的细胞内IL-6 mRNA的相对表达值显著降低。3)Western-blot检测IL-6蛋白的表达CGRP组相对于空白对照组,IL-6蛋白的表达量显著升高,CGRP+siRNA组相对于CGRP组,事先用siRNA处理过的细胞内IL-6蛋白的表达量显著降低。这与qPCR的结果相一致。5.circRNA对IL-6上游miRNA作用的验证1)miRNA的筛选经过mi RDB（www.mirdb.org）、David（david.ncifcrf.gov）和Target Scan（www.targetscan.org）生物信息学网站的筛选得出,mmu-mi R-485-5p最有可能是由mmu_circRNA₀07893介导的,作用于IL-6 mRNA的miRNA。mmu-mi R-485-5p在该circRNA上具有至少5个结合位点。2)qPCR验证circRNA对选定miRNA表达水平的影响CGRP组相对于空白对照组,mmu-mi R-485-5p的相对表达值显著降低,CGRP+siRNA组相对于CGRP组,事先用siRNA处理过的细胞内mmu-mi R-485-5p的相对表达值显著升高。6.目标miRNA对IL-6表达作用的验证1)qPCR检测IL-6 mRNA的表达CGRP组相对于空白对照组,IL-6 mRNA的相对表达值显著升高,CGRP+mimics组相对于CGRP组,事先用mmu-mi R-485-5p过表达试剂处理过的细胞内IL-6 mRNA的相对表达值显著降低。CGRP+inhibitor组相对于CGRP组,事先用mmu-mi R-485-5p干扰试剂处理过的细胞内IL-6 mRNA的相对表达值显著升高。2)Western-blot检测IL-6蛋白的表达CGRP组相对于空白对照组,IL-6蛋白的表达量显著升高,CGRP+mimics组相对于CGRP组,事先用mmu-mi R-485-5p过表达试剂处理过的细胞内IL-6蛋白的表达量显著降低。CGRP+inhibitor组相对于CGRP组,事先用mmu-mi R-485-5p干扰试剂处理过的细胞内IL-6蛋白的表达量显著升高。这与qPCR的结果相一致。结论1.当CGRP浓度为1nM时,IL-6 mRNA相对表达水平最高。2.当CGRP作用时间为2小时时,IL-6 mRNA相对表达水平最高。3.使用选定浓度的CGRP刺激选定时间后,mmu_circRNA₀07893的表达显著升高。4.mmu_circRNA₀07893主要存在于细胞质当中。5.mmu_circRNA₀07893对IL-6 mRNA及蛋白的表达具有正向调节作用。6.mmu-mi R-485-5p是mmu_circRNA₀07893调节的下游miRNA,且mmu_circRNA₀07893对该miRNA具有负向调节的作用。7.mmu_circRNA₀07893通过对mmu-mi R-485-5p表达的调控,从而影响IL-6mRNA及蛋白的表达。