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锁骨颅骨发育不良综合征（cleidocranial dysplasia, CCD）是一种罕见的常染色体显性遗传性疾病,其临床表现主要有:锁骨的发育不良、囟门闭合延迟或完全不闭合、沃姆骨、恒牙迟萌、多生牙以及其它骨骼的变化。定位于染色体6p21上的成骨细胞特异性基因RUNX2（runt-related transcription factor 2 gene, RUNX2）的杂合突变、基因缺失、基因插入是造成CCD的重要原因。作为间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）向成骨细胞方向分化过程中关键的转录因子,RUNX2对于骨的正常发育至关重要,并对成骨细胞的成熟和稳态起着关键作用。目前国内关于CCD致病基因突变的报道尚不多见,尚未涉及基因突变对发育以及发育相关干细胞生物学行为的研究。本研究收集包含一例CCD患者的临床家系,对患者的致病基因突变位点进行检测,并分离培养患者骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs）以及牙髓干细胞（dental pulp stem cells, DPSCs）,探究RUNX2突变情况下骨及牙齿发育相关的干细胞的生物学行为变化,从一个新的角度对造成CCD患者骨及牙齿发育缺陷进行探讨。本文内容分为三个部分,小结如下:第一部分锁骨颅骨发育不良综合征患者临床检查与分析及致病基因突变位点检测本课题研究对象为1例囟门未闭合的成年男性患者,我们对患者进行了详细的临床检查并对其拔除牙齿进行扫描电镜检测。临床检查结果发现患者主要表现为身材矮小、短指畸形、胸部成漏斗状以及脊柱裂、双侧锁骨发育不良、前后囟门均未闭合。口腔的表现主要有乳牙滞留、多生牙以及异常发育的牙根。根据患者的临床检查结果,该患者可初步诊断为锁骨颅骨发育不良综合征。为了确定该患者RUNX2基因的突变位点,我们分析了患者、患者健康的父母以及其它跟患者不相关的正常人的基因组DNA。基因突变分析发现,患者RUNX2基因外显子7上出现单个碱基C的插入移框突变（c. 1116–1119insC）,而该家系中健康成员以及跟该患者不相关的正常人RUNX2基因均为野生型序列,进一步证明RUNX2基因是患者的致病基因,正是该基因的突变导致了该患者严重的CCD表型。扫描电镜检测发现,患者牙本质矿化程度低、牙髓腔侧牙本质小管开口分布不规则、管周和管间牙本质矿化程度低、胶原松散。扫描电镜检测结果证实了RUNX2基因突变对CCD患者牙齿结构的影响,再次证明了RUNX2基因对于牙齿正常发育的重要性。第二部分锁骨颅骨发育不良综合征患者骨髓间充质干细胞及牙髓干细胞的生物学行为研究骨基质的沉积以及骨的形成源于成骨细胞,开始于发育期一直持续到出生后。来源于骨髓和牙髓组织的间充质干细胞在体外能够分别向成骨细胞和成牙本质细胞方向分化,并且将其移植于裸鼠皮下时能够形成骨/牙样矿化组织,然而关于间充质干细胞与骨/牙发育之间的联系目前仍然不清楚。本研究中,我们调查了CCD患者来源的骨髓间充质干细胞和牙髓干细胞,我们发现RUNX2突变导致了MSCs降低的增殖能力和成骨分化潜能,而且,令人吃惊的是,和正常健康人(RUNX2+/+)BMMSCs相比,CCD患者(RUNX2+/m)BMMSCs成骨细胞特异性基因（runt-related transcription factor 2 gene RUNX2, alkaline phosphatase ALP）出现了高表达,而OCN （osteocalcin, OCN）的表达两组细胞之间却没有明显差异,我们推测RUNX2突变情况下可能存在着一种负反馈。通过研究1例罕见的遗传性疾病,我们确定了一个新的突变位点以及该突变导致的改变了的MSCs生物学特性。CCD患者MSCs降低的向成骨细胞分化的能力为该患者骨/牙畸形或缺陷提供了一个合理的分子解释。第三部分锁骨颅骨发育不良综合征患者骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin信号通路研究成体组织中的干细胞被认为是肿瘤、疾病以及老化等情况下组织更新的储蓄池,而越来越多的研究表明Wnt信号通路在调节这种成体组织干细胞的自我更新以及分化潜能方面发挥着关键作用。RUNX2突变情况下RUNX2+/m BMMSCs降低的分化潜能能否通过调控Wnt/β-catenin信号通路而得以改善,目前尚不清楚。本部分研究中,我们利用外源性重组蛋白Wnt3a和DKK-1来激活或抑制Wnt/β-catenin信号通路。结果显示:在正常对照组RUNX2+/+ BMMSCs中,成骨相关基因OCN、RUNX2和ALP的表达在加入Wnt3a时出现下调,而在加入DKK-1时出现上调;而在CCD患者来源的RUNX2+/m BMMSCs中,成骨相关基因OCN、RUNX2和ALP的表达在加入Wnt3a时也是出现下调,而在加入DKK-1时表达却没有明显改变。对RUNX2蛋白的Western blot分析证实了同样的结果。我们研究的结果表明,该CCD患者BMMSCs降低的分化潜能不能通过调控Wnt/β-catenin信号通路而得以改善。