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转录因子通过与防御反应基因启动子上的顺式作用元件的结合激活防御反应基因的表达,在植物防御反应中起重要的调节作用。转录因子的分离、功能鉴定是开展植物抗逆机制研究的重要途径。本研究分别从大白菜(Brassica rapa subsp.pekinensis)和辣椒(Capsicum annuum L.)中分离获得可能参与抗逆反应的转录因子1个 BpERF1(ethylene responsive element binding factors,ERF)和3个CabZIP(basic leucinezipper,bZIP)基因,通过农杆菌介导的方法分别获得它们的转基因烟草植株,并对BpERF1在烟草中的超表达对抗病作用的影响进行了初步分析,主要结果如下:
1.从热害处理的大白菜叶片cDNA文库中分离获得一个AP2/ERF基因,氨基酸序列分析显示该基因为AP2基因家族ERF亚类,含有一个由58个氨基酸残基组成的AP2结构域,对其蛋白三维结构预测结果与前人研究拟南芥AtERF1蛋白结构一致;并且,瞬间表达分析表明,BpERF1只能结合GCC盒,不能结合DRE元件,因此将其命为BpERF1。通过Gateway载体构建技术,采用BpERF1开放读码框和Gateway目的载体pMDC32,构建成BpERF1的植物超表达载体并通过农杆菌介导的遗传转化方法转化烟草,获得烟草转基因T0植株,自交获得T1代种子。以BpERF1转基因烟草的T1代苗进行表形性状分析及抗性鉴定,发现部分超表达BpERF1的烟草苗表现出顶端优势丧失现象;BpERF1在烟草中超表达对烟草耐盐性、耐旱性、耐高温及耐低温影响不明显;病原物接种实验结果表明,超表达BpERF1的烟草降低了对假单胞杆菌番茄致病变种DC3000、辣椒疫霉及烟草花叶病毒的抗性。这些结果表明BpERF1在植物病菌防御反应中起负调节作用。
2.茄科植物中倍半萜植保素的诱导合成在植物抗病反应中起重要的调节作用,但对其调节的分子机制还不太清楚,我们前期的研究表明在辣椒倍半萜的启动子序列中发现bZIP结合的G盒,推测bZIP可能在倍半萜植保素诱导合成中起重要调节作用。本研究根据GenBank上搜索获得的三个辣椒碱性亮氨酸拉链(bZIP)基因的核苷酸序列设计引物,采用PCR扩增法从以Uv照射处理的辣椒为材料构建的cDNA文库中分别获得该3个基因的3段目的序列,用于构建它们的超表达载体,转基因RNAi干扰载体及病毒诱导沉默(VIGS)载体。采用Gateway高通量载体构建技术,构建了这3个CabZIP基因的植物超表达载体,RNAi载体及VIGS载体。采用农杆菌侵染法将3个超表达载体转化烟草,并获得其中2个基因的T0代转基因烟草苗,为进一步分析bZIP在植物对病害等逆境及植保素诱导合成中的调节作用奠定了基础。