再灌注是治疗急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)等缺血性心脏病(ischemic heart disease, IHD)的有效方法。但心肌缺血后一定时间内的再灌注,可对缺血心肌造成再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤,包括心律失常、心肌舒缩功能障碍(心肌顿抑)、心梗面积扩大等。关于再灌注损伤的机制,主要有氧自由基大量产生、钙离子超载、内皮细胞和中性粒细胞激活的炎症反应以及以细胞凋亡(apoptosis)等。启动这些环节的关键途径,是心肌细胞三磷酸腺苷(ATP)生成缺乏,能量供应障碍。线粒体(mitochondria)是细胞内的“能量加工厂”,通过氧化磷酸化产生ATP为细胞活动提供能量。近年来研究证实,线粒体功能障碍是造成心肌I/R损伤、诱导I/R心肌细胞凋亡(apoptosis)的重要病理机制之一,包括线粒体ATP生成减少、Ca2+超载、活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)大量产生、线粒体片段化及线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)的持续开放等。因此,研究线粒体参与心肌I/R损伤的分子机制,通过线粒体途径减轻心肌I/R损伤,对改善AMI患者的临床及预后具有重要意义。mPTP在再灌注初期的持续性开放,是造成线粒体功能障碍的主要原因。mPTP存在于线粒体内膜上,是一个具有高导电性的蛋白复合通道。近年研究发现,I/R会诱导线粒体膜通透性增加、离子平衡失调、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, Δψm)丧失,造成mPTP开放。mPTP在再灌注初期的持续性开放会破坏线粒体结构及功能,使ATP耗竭,线粒体肿胀甚至破裂,并激活线粒体凋亡通路(mitochondrial apoptosis pathway),使心肌细胞凋亡增加,进一步加重心肌I/R损伤。研究证明,通过直接干预mPTP组成部分或间接减少造成孔道开放的诱因(如Ca2+超载、ROS大量产生、pH升高),抑制mPTP持续性开放,对预防线粒体功能障碍及心肌I/R损伤具有重要作用。磷脂酰肌醇3磷酸激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)信号通路是体内重要的细胞信号通路,糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)是PI3K/Akt通路的作用底物之一。最新研究表明,激活PI3K/Akt通路能促进GSK-3β磷酸化,磷酸化的GSK-3β可通过与mPTP亚基之间的相互作用抑制mPTP开放。因此,PI3K/Akt/GSK-3β通路的激活被认为是抑制mPTP开放的一个重要机制。西洋参茎叶总皂甙(Panax quinquefolius Saponins, PQS)是从西洋参茎叶中提取的活性成分,作为上市药在中国应用于治疗冠心病已有近20年历史。基础研究证实,PQS具有抗心肌I/R损伤、增强心肌能量代谢、改善AMI后心室重构、调节血脂代谢、抗动脉粥样硬化、抗心律失常、抗AMI后使用双抗(阿司匹林+氯吡格雷)所致胃粘膜损伤等作用。本课题组在前期研究心肌I/R损伤时,观察PQS预处理与内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)司的关系,结果证实PQS可通过抑制过度ERS,减轻在体及离体大鼠心肌细胞I/R损伤,改善AMI所致的心室重构,其机理与抑制CHOP介导的ERS相关凋亡途径有关。PQS对I/R心肌细胞的保护作用是否与抑制mPTP开放及线粒体相关凋亡通路的激活有关?其机制是否由PI3K/Akt通路的活化及GSK-3β磷酸化水平的上调介导?目前国内外尚缺少研究。因此,本研究采用大鼠心肌I/R损伤模型,研究PQS对心肌I/R损伤后线粒体结构、功能、mPTP开放程度及线粒体凋亡通路的影响,探讨PQS发挥I/R心肌保护作用的可能机制；进一步在模拟在体I/R损伤的乳大鼠心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)模型上,研究PQS对H/R心肌细胞mPTP的抑制作用及其与PI3K/Akt通路及GSK-3p磷酸化之间的关系。本研究主要由在体实验研究和离体实验研究构成。1.在体实验研究：西洋参茎叶总皂苷对缺血/再灌注大鼠心肌线粒体膜通透性转换孔及细胞凋亡的影响目的：旨在证实PQS通过抑制mPTP开放介导的线粒体凋亡通路,减轻大鼠I/R损伤后的心肌细胞凋亡。方法：健康雄性SD大鼠90只,随机分为假手术(sham)组、缺血/再灌注(I/R)组、PQS (200mg·kg-1·d-1,灌胃4周)+缺血/再灌注(PQS+I/R)组、mPTP特异性抑制剂环孢霉素A (CsA)组、环孢霉素A(10mg·kg-1,再灌前10 min腹腔注射)+缺血/再灌注(CsA+I/R)组、PQS+环孢霉素A+缺血/再灌注(PQS+CsA+I/R)组,各组n=15。除sham组和CsA组大鼠开胸后左冠状动脉前降支(left anterior descending coronary artery, LAD)下穿线不结扎外,其余各组大鼠常规麻醉后,结扎LAD 30min,再灌注120 min复制I/R模型。颈动脉插管测血流动力学指标,生化分析仪测血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)及血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB, CK-MB)含量,H-E染色观察心肌病理改变,氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyhetrazolium chloride, TTC)和伊文思蓝(Evan’s blue)双染法测心梗面积,原位缺口末端标记法(TUNEL)测各组大鼠心肌细胞凋亡情况；透射电镜观察线粒体超微结构；各组另取5只大鼠,复灌10 min时取左室前壁心肌组织,差速离心法提取线粒体,紫外分光光度计测定mPTP开放程度；采用JC-1作为荧光探针,用激光共聚焦显微镜和荧光酶标仪测定△Ψm水平；Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达。结果：与sham组比较,I/R组大鼠平均动脉压(MAP)、心率-血压乘积(RPP)、左室收缩压(LVSP)、左室发展压(LVDP)、左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)绝对值分别低26.33%、32.87%、22.33%、53.58%、39.86%、42.91%(均P<0.05),左室舒张末压(LVEDP)高1.13倍,血清LDH及CK-MB含量均高1.06倍,心梗面积高42.4%,心肌细胞凋亡率高6.08倍(均P<0.05)；与I/R组相比,PQS+I/R组和PQS+CsA+I/R组大鼠MAP分别高14.72%、10.81%,RPP分别高32.42%、21.60%,LVSP分别高21.17%、18.14%,LVDP分别高93.81%、68.06%,+dp/dtmax绝对值分别高56.01%、41.64%,-dp/dtmax绝对值分别高64.15%、53.12%,LVEDP分别低50.18%、45.83%(均P<0.05)；PQS+I/R组、CsA+I/R组、PQS+CsA+I/R组大鼠血清LDH分别低38.2%、31.0%、39.3%,血清CK-MB含量分别低45.27%、42.83%、46.61%,心梗面积分别低50.3%、38.7%、39.4%,心肌细胞凋亡率分别低40.7%、46.4%和39.1%(均P<0.05)；mPTP特异性抑制剂CsA组大鼠血流动力学水平较I/R组相比未见显著性差异(P>0.05)。H-E染色示I/R组大鼠心肌病理损伤主要表现为肌纤维排列不规则、结构紊乱、局部横纹消失、心肌萎缩、心肌间质水肿、部分肌细胞萎缩造成核聚集、局部炎细胞浸润等,其他各组大鼠,肌病理损伤程度均较I/R组减轻。透射电镜观察显示,I/R组大鼠心肌线粒体肿胀、嵴稀疏或断裂消失、部分线粒体破裂,其他各组大鼠线粒体外膜完整性、内膜嵴质密程度等超微结构均明显优于I/R组,PQS+I/R、CsA+I/R、PQS+CsA+I/R三组间无明显差异。与sham组比较,I/R组大鼠再灌注10 min时mPTP吸光度比值△A540降低(P<0.05),PQS+I/R、CsA+I/R、PQS+CsA+I/R组mPTP吸光度比值△A540均较I/R组升高(P<0.05),三组间△A540无显著性差异(P>0.05)。Western blot结果显示,与sham组相比,I/R组大鼠心肌Bcl-2蛋白表达量降低,Bax、胞浆cytochrome c、cleaved-caspase-3蛋白表达量均升高(均P<0.05)；与I/R组相比,PQS+I/R组、CsA+I/R组、PQS+CsA+I/R组大鼠心肌Bcl-2蛋白表达量升高,Bax、胞浆cytochrome c、cleaved-caspase-3蛋白表达量均降低(均P<0.05)。激光共聚焦显微镜观察结果示,与sham组相比,I/R组大鼠线粒体JC-1染色后红色荧光强度减弱,荧光酶标仪测定相对荧光单位(relative fluorescence units, RFU)较sham组低61.3%(P<0.05)；与I/R组相比,PQS+I/R组、CsA+I/R组和PQS+CsA+I/R组大鼠线粒体红色荧光强度增强,RFU值分别较I/R组高64.2%、88.3%和79.4%(均P<0.05)。结论：PQS可显著减轻大鼠心肌I/R损伤,减少心肌细胞凋亡,其机制与保护线粒体结构、维持△Ψm稳定、抑制再灌注初期mPTP开放及线粒体凋亡通路的激活有关。2.离体实验研究：西洋参茎叶总皂苷通过激活PI3K/Akt/GSK-3p通路抑制缺氧/复氧心肌细胞线粒体膜通透性转换孔开放的研究目的：研究PQS通过激活PI3K/Akt/GSK-3p通路抑制mPTP开放,减轻H/R诱导的心肌细胞凋亡。方法：用新生大鼠心肌细胞建立H/R损伤模型,以模拟在体I/R损伤,原代培养的心肌细胞分为正常对照(control)组,缺氧/复氧(H/R)组,PQS预处理+缺氧/复氧(PQS+H/R)组,PQS+LY294002预处理+缺氧/复氧(PQS+LY294002+H/R)组,并设LY294002预处理+缺氧/复氧(LY294002+H/R)组以排除P13K特异性抑制剂LY294002本身对H/R心肌细胞的影响。将心肌细胞置于三气培养箱缺氧8h(37℃,O2含量5%,N2含量90%,CO2含量5%),后置于37℃ 5% CO2培养箱复氧16h建立心肌细胞H/R损伤模型。所有干预药物均于H/R处理开始前24h加入培养基中。用比色法检测细胞培养液LDH活性,CCK-8法检测细胞存活率,TUNEL法及Annexin V/PI双染法检测心肌细胞凋亡率,Fluo-4,AM荧光染色检测胞浆内Ca2+含量、荧光素酶定量法检测ATP水平,JC-1染色测定△Ψm变化,钙黄绿素染色测定mPTP开放程度,并通过western blot法对细胞内Akt、p-Akt、 GSK-3β、p-GSK-3β及线粒体凋亡通路相关蛋白的表达水平进行定量分析。结果：与正常对照组比较,H/R组心肌细胞培养液LDH活性、心肌细胞凋亡率、胞浆Ca2+含量均显著升高(均P<0.05),细胞存活率降低(P<0.05)；与H/R组相比,PQS+H/R组心肌细胞培养液LDH活性、心肌细胞凋亡率、胞浆Ca2+含量均显著降低(均P<0.05),细胞存活率显著升高(P<0.05)；P13K特异性抑制剂LY294002能部分抑制PQS的H/R心肌保护作用,与PQS+H/R组比较,PQS+LY294002+H/R组细胞培养液LDH活性、心肌细胞凋亡率、胞浆Ca2+含量均显著升高(均P<0.05),细胞存活率显著降低(P<0.05)。在线粒体功能检测方面,与正常对照组比较,H/R预处理会造成心肌细胞mPTP开放程度增加,△Ψm水平降低,ATP含量下降(均P<0.05)；与H/R组比较,PQS+H/R组心肌细胞mPTP开放程度降低,△Ψm水平升高,ATP含量增加(均P<0.05)；与PQS单独预处理作用相比,PQS+LY294002+H/R组△Ψm及ATP含量显著降低(均P<0.05),mPTP开放程度增加(P<0.05)。Western blot结果显示,与正常对照组相比,H/R组心肌细胞p-Akt、p-GSK-3β蛋白表达量升高,cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著上调(均P<0.05),线粒体cytochrome c/胞浆cytochrome c (mito-Cyt c/cyt-Cyt c)比值明显降低(P<0.05)；与H/R组相比,PQS+H/R组能显著上调p-Akt、 p-GSK-3β蛋白表达水平(均P<0.05),明显减少cytochrome c从线粒体向胞浆的转位及cleaved-caspase-3蛋白表达水平(均P<0.05)；LY294002预处理能抑制PQS对Akt及GSK-3p磷酸化水平的上调,与PQS+H/R组相比,PQS+LY294002+H/R组p-Akt、 p-GSK-3β蛋白表达水平显著降低,mito-Cyt c/cyt-Cyt c下降(均P<0.05),cleaved-caspase-3蛋白表达水平上调(P<0.05)。结论：PQS预处理通过激活PI3K/Akt通路、上调GSK3P磷酸化水平抑制mPTP开放,减轻H/R诱导的乳大鼠心肌细胞凋亡。