第一部分 孕期高胆固醇血症通过改变下丘脑瘦素信号诱导雄性子代肥胖背景:母亲肥胖影响孩子的长期发展和健康。进一步的母体过度营养已经被证明导致多器官系统中的后代代谢编程,例如胰腺和肝脏,以及涉及能量平衡的中枢和外周神经系统。人类流行病学和实验动物研究显示母亲饮食与牛奶成分之间存在相关性。尽管肥胖是一种大量过剩体内能量（脂肪）积累的状态,肥胖个体的行为和生理状态反映了在能量负平衡状态下所促进的,包括食欲过盛和低代谢率。在正常情况下,涉及长期能量平衡的大脑区域,通过定义,必须感知身体内现有能量的数量,并利用这些信息调整能量的摄入和消耗。也就是说,通过监视和响应身体能量储存的改变,能量稳态得以保持:负能量平衡促进食物摄入并限制能量消耗,反之亦然。然而,在大多数情况下,通过燃料分子（即葡萄糖或脂质）的循环水平不能检测到身体能量水平,但是如上所述,通过瘦素来检测身体能量水平,所述瘦素指示存储的能量的量。当循环中的瘦素水平高时,下丘脑和大脑其他部位的神经元呈现高能量状态,从而抑制食物摄取并增加能量消耗。然而,当瘦素信号被破坏时,如在瘦素抵抗中,或者在极端情况下,在瘦素或瘦素受体缺陷中,能量平衡机制认识到极度负能量平衡的状态,并启动各种行为和生理反应,而不管实际身体能量储存。但是,这个过程中涉及的机制还不确定。在本研究中,我们探讨了雌性大鼠怀孕期间高脂饮食过量是否改变了 F1代的代谢表型,并验证了下丘脑瘦素信号传导的作用。方法:从上海实验动物中心购买重达140-160g的六周龄Sprague-Dawley（SD）大鼠,并在中国杭州浙江大学动物中心饲养（12:12h黑暗/光照周期）。适应2周后,将雌性大鼠随机分为正常对照组（饲料组,20只）和高脂饲料组（HFD,20只）（附表1）。雌性SD大鼠在10周时与正常的雄性SD大鼠交配,并且怀孕雌性从8周喂食或HFD至分娩。在过夜交配后（指定为怀孕第0天）,通过交配塞的存在评估妊娠发作。我们进行了其他代谢激素的生化分析。通过qRT-PCR分析瘦素应答和磷酸化信号转导物和激活物转录3（pSTAT3）的免疫阳性神经元的数目。下丘脑pSTAT3蛋白免疫组织化学,免疫荧光和蛋白质印迹。采用免疫组织化学,蛋白质印迹和免疫荧光技术检测下丘脑弓状核和孤束核中神经肽Y的含量。结果:HFD-P1大鼠血清TG和瘦素水平均显着高于对照组。另一方面,HFD-P1中的脂肪细胞面积也显着增加。此外,我们发现HFD-F1后代的血清瘦素浓度也显着高于Chow-F1后代。两组早期体重相同。后来HFD-F1变得比Chow-F1重,直到第29天.HFD-F1后代的附睾中白色脂肪组织的重量,体长和脂肪细胞大小显著增加。HFD-F1每日食用量高于Chow-F1组。与Chow-F1相比,高脂饮食-F1后代中神经肽Y阳性细胞体和神经元的数目显着增加。瘦素给药显着降低了食物摄入量,并增加了 Chow-F1弓状核神经元中pSTAT3的表达水平。然而,瘦素对食物摄取没有任何影响,并且对HDF-F1弓形核神经元中pSTAT3表达水平的影响降低。HFD组和对照组的血液蛋白质无显著差异。结论:从目前的多米诺骨牌效应,我们得出结论:怀孕期间接触高脂饮食的母亲可能通过改变下丘脑瘦素信号传递肥胖表型到下一代。第二部分 雄激素诱导难免流产患者子宫内膜关键蛋白改变背景:多囊卵巢综合征是一种典型的荷尔蒙紊乱。无排卵,月经不调和高雄激素血症是PCOS患者的主要特征。子宫内膜是一个复杂的,类固醇依赖组织,经历动态的周期性重塑。将基质成纤维细胞转化为专门的分泌细胞（蜕膜化）是建立可支持和维持妊娠的接受性子宫内膜微环境的基础。类固醇激素及其受体包括不同疾病的启动子或终止子。人类子宫内膜是雄激素靶组织,雄激素受体在整个月经周期的子宫内膜中表达。高雄激素水平影响女性子宫内膜容受性反复流产。流产的风险因各种遗传和环境因素而增加。最近,各种基因多态性已被假设为影响复发性流产的风险,但不同研究的结果往往是有争议的。雄激素在子宫内膜上的作用机制尚不明确。我们假设雄激素对复发性流产妇女的子宫内膜有直接的影响。方法:在本研究中,我们评估雄激素（A₂）在高浓度(10^-7M)对IK细胞的影响与雄激素(10^-9M)的生理浓度相比。原代培养的人子宫内膜细胞取自浙江大学医学院妇科医院,在含10%牛血清白蛋白的DMEM中培养。IK细胞株来自上海生命科学研究院,并保存在含有10%胎牛血清和100U/ml青霉素和链霉素抗生素RPMI1640培养基中。当细胞达到完全融合时,将培养基替换为补充有10%木炭/葡聚糖处理的FBS的无酚红RPMI 1640。通过细胞裂解缓冲液（RIPA裂解缓冲液）从两组IK细胞和原代人子宫内膜细胞中提取蛋白质。将这些粗蛋白质用胰蛋白酶消化并进行更深入的分析,根据制造商的说明,我们使用通过2D-LC MS/MS追踪的8重iTRAQ试剂的全球稳定同位素标记概况分析策略。对子宫内膜上皮蛋白受体的定位进行免疫荧光。通过蛋白质印迹分析蛋白质。使用siRNA进行特定基因的敲低,然后进行迁移,增殖,侵入和Jar球体附着测定。结果:我们确定175个非冗余蛋白质,其中18个使用非靶向蛋白质组分析进行定量。使用WEKA软件,我们发现了 18个显着的差异表达蛋白（DEP）。DEPs分析发现8个上调蛋白质和10个下调高雄激素组。这些DEP通过独特性途径（IPA）分析进行检查,并确定这些蛋白在复发性流产和子宫内膜容受性中起重要作用。我们还建立了 IPA网络和6条标准通路,包括p53信号传导,年轻信号传导成熟型糖病,黑色素瘤信号传导,p14/p19ARF肿瘤抑制信号传导,G2/MDNA损伤检查点和Myc介导的细胞凋亡信号传导。生物信息学分析提示这些来自IK细胞的DEP可能与RM和子宫内膜功能障碍有关。此外,使用蛋白质印迹独立地证实蛋白质细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2a（CDKN2a）,内皮蛋白C受体（EPCR）,velocardiofacial的犰狳重复（ARVCF）。IK细胞和人子宫内膜上皮细胞的western印迹结果与iTRAQ分析一致。CDKN2a,EPCR和ARVCF在供体女性子宫内膜上皮组织中的表达模式通过免疫荧光检查。所有这些蛋白质都位于子宫内膜上皮细胞上。为了确定CDKN2a在细胞迁移,侵袭和IK细胞增殖中的作用,我们将靶向CDKN2a的siRNA转染到IK细胞中。与转染siRNA的细胞相比,用CDKN2asiRNA处理IK细胞36小时显着降低了CDKN2a蛋白的表达水平。为了探索CDKN2a在RM中的作用,在细胞迁移,增殖,侵袭和Jar球体附着实验中将基因特异性siRNA应用于IK细胞。如所预期的,敲减CDKN2a显着降低了细胞迁移（p<0.01）,入侵（p<0.05）,增殖（p<0.05）和Jar球体附着于Ishikawa细胞单层的比率（p<0.05）。结论:本研究结果提示,高浓度雄激素可能改变子宫内膜发育和胚胎着床相关蛋白的表达水平,这可能是子宫内膜容受性和流产受损的原因之一。