在水产养殖过程中，水产动物经常遭遇水温剧变、水质恶化等环境因子的应激，这些应激会影响水产动物的生长、发育、生理功能以及生存。暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）具有适应能力强、生长速度快、营养丰富等特点，有广泛的发展前景。但是，近年来暗纹东方鲀养殖疾病越来越多，逐渐成为制约其养殖发展的瓶颈。因此，本论文主要通过研究环境（温度和氨氮）胁迫对暗纹东方鲀生理生化指标的影响，揭示暗纹东方鲀对温度、氨氮胁迫的生理响应机制。在此基础上，研究了在饲料中分别添加维生素E、虾青素和牛磺酸对暗纹东方鲀生长、免疫以及抗应激影响。本论文包括以下8个部分，主要结果如下:　　1.暗纹东方鲀细胞凋亡Bcl-2基因克隆及表达分析　　采用RACE技术克隆了暗纹东方鲀细胞凋亡Bcl-2基因。暗纹东方鲀Bcl-2基因全长为1412 bp，5′编码区为355bp，3′编码区为400 bp并且包含终止信号AATAA和一个polyA的加尾序列，开放阅读框为657 bp，编码219氨基酸。预测Bcl-2蛋白分子量约为24.2 kD，理论等电点为5.27。蛋白结构Smart分析显示暗纹东方鲀Bcl-2蛋白包含4个Bcl-2家族BH结构域。Bcl-2在所有组织中均有表达，其中在血细胞和肝胰腺中表达量最高。嗜水气单胞菌应激后，肝脏中Bcl-2基因表达水平从6小时开始显著上调，然后表达量逐渐上升，在48小时达到最高值，在72小时又恢复到正常水平。除此之外，构建了Bcl-2基因原核表达载体，并对Bcl-2基因进行了原核诱导表达和多克隆抗体制备。Western分析发现嗜水气单胞菌应激初期Bcl-2蛋白表达量升高。　　2.暗纹东方鲀Bax inhibitor-1基因克隆与表达分析　　采用RACE技术克隆了暗纹东方鲀细胞凋亡Bax inhibitor-1基因。暗纹东方鲀Bax inhibitor-1全长为1387 bp，5′编码区为82 bp，3′编码区为591bp并且包含一个polyA尾巴，开放阅读框为591 bp，编码237个氨基酸。Bax inhibitor-1蛋白分子量为26.13 kDa，等电点为8.87。通过SMART软件预测Bax inhibitor-1蛋白含有6个跨膜结构域。Bax inhibitor-1在所有组织中均由表达，其中在血细胞中表达量最高，在肌肉中表达量最低。在氨氮和高温应激下，Bax inhibitor-1基因都出现了上调。通过亚细胞定位发现，Bax inhibitor-1主要定位在Hella细胞质中。过表达分析发现Bax inhibitor-1能够激活NF-κB报告基因。　　3.暗纹东方鲀p53基因克隆与表达分析　　采用RACE技术克隆了暗纹东方鲀p53基因。暗纹东方鲀p53全长为1537bp，5′编码区为157 bp，3′编码区为285bp，开放阅读框为1095 bp，编码364个氨基酸。p53蛋白分子量为40.6 kDa，等电点为8.03。Blastx分析发现暗纹东方鲀p53与其它物种p53氨基酸序列具有较高的同源性。通过SMART软件预测p53蛋白含有N端的转录活化结构域和中间的DNA结合结构域。p53在所有组织中均有表达，其中在肾脏和肝脏中表达量最高，在肌肉和脾脏中表达量最低。弧菌应激发现p53基因在3h，6h和12h表达量逐渐升高，并且在12h表达量达到最高，之后逐渐降低。亚细胞定位发现p53主要定位在Hella细胞核中。p53过表达发现，p53能够抑制Hella细胞增值和NF-κB报告基因。　　4.氨氮胁迫对暗纹东方鲀细胞凋亡和免疫指标的影响　　将暗纹东方鲀暴露于不同氨氮浓度(0、20、50、100 mg L-1)的水体中72 h，在胁迫后0、3、6、12、24、48和72 h后取样。结果显示:氨氮应激能够增加暗纹东方鲀体内活性氧含量，破坏细胞质中钙离子的平衡性，导致了DNA损伤以及细胞凋亡。p53-Bax-Bcl2和Caspase信号通路参与了氨氮诱导细胞凋亡。除此之外，氨氮应激能够产生炎症反应，激活暗纹东方鲀机体抗氧化系统和热应激蛋白系统。　　5.温度胁迫对暗纹东方鲀血清生化、免疫以及细胞凋亡的影响　　研究了连续降温和升温过程中暗纹东方鲀血清生化、免疫以及细胞凋亡变化情况。结果表明:温度胁迫后，血清中碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、葡萄糖、总蛋白和乳酸脱氢酶发生改变。血细胞数量和活力降低，DNA损伤程度增加。肝脏中CAT、SOD、Caspase-9、Caspase-3、p53、C3、HSP90、CYP基因表达量显著升高，而IGF-1基因表达量下调。以上结果显示，温度应激可以导致暗纹东方鲀的生理机能发生改变，降低机体的免疫机能，影响鱼类的生长发育。　　6.饲料中添加维生素E对暗纹东方鲀生长、免疫及抗氨氮应激的影响　　在基础饲料中分别添加0、20、40、80、160、320 mg/kg维生素E，共制成6种饲料，每组设3个平行，每个水族缸放30尾鱼苗，60天饲养实验后，进行氨氮应激实验。结果表明:维生素E组显著提高了暗纹东方鲀增重率和特定生长率，降低了饵料系数。饲料中添加维生素E组显著提高了暗纹东方鲀血清中碱性磷酸酶活性，降低了血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性。荧光定量分析发现，饲料中添加维生素E组能够提高暗纹东方鲀肝脏中生长轴IGF-1和GHR基因表达量。氨氮应激48 h后发现:添加适量的维生素E能够提高暗纹东方鲀肝脏中P450、HSP70、Mn-SOD、CAT和GR基因表达量，降低氨氮应激产生的ROS水平。以上结果显示，在饲料中添加维生素E可显著提高暗纹东方鲀的生长、免疫和抗氨氮应激能力。　　7.饲料中添加虾青素对暗纹东方鲀生长、免疫及抗高温应激的影响　　在基础饲料中分别添加0、20、40、80、160、320 mg/kg虾青素，共制成6种饲料，每组设3个平行，每个水族缸放30尾鱼苗，56天饲养实验后，进行高温应激实验。结果表明:饲料中添加80、160和320mg/kg虾青素组能显著提高了暗纹东方鲀增重率和特定生长率。添加适量的虾青素组显著提高了暗纹东方鲀血清中碱性磷酸酶活性，降低了暗纹东方鲀血清中谷丙转氨酶活性。34℃高温应激后发现:添加适量的虾青素组显提高了暗纹东方鲀肝脏中HSP70、Mn-SOD和CAT基因表达量，降低了高温产生的ROS水平。以上结果显示，在饲料中添加适量的虾青素可显著提高暗纹东方鲀的生长、免疫和抗高温应激能力。　　8.饲料中添加牛磺酸对暗纹东方鲀生长、免疫及抗低温应激的影响　　在基础饲料中分别添加300、600、900、1200、1500 mg/kg牛磺酸，共制成6种饲料，每组设3个平行，每个水族缸放20尾鱼苗，56天饲养实验后，进行低温应激实验。结果表明:饲料中添加牛磺酸300-1500 mg/kg后，暗纹东方鲀增重率和特定生长率均比对照组显著提高。当温度从25℃逐渐降到13℃后，添加适量牛磺酸显著提高了暗纹东方鲀肝脏中HSP70、Mn-SOD、C3、GPx和CAT基因表达量。低温应激能够产生ROS和增加细胞凋亡率，而与对照组相比，添加适量的牛磺酸能够降低ROS和细胞凋亡率，稳定细胞质中钙离子。以上结果显示，在饲料中添加适量的牛磺酸可显著提高暗纹东方鲀的生长、免疫和抗低温应激能力。