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枇杷（Eriobotrya japonica Lind.）属于蔷薇科（Rosaceae）枇杷属（Eriobotrya）,是我国南方重要经济果树之一。枇杷的花、叶、果实均可被充分利用,但由于枇杷果实核多可食率低的原因,故培育三倍体无核枇杷是育种中的主要任务之一。三倍体枇杷育性低于二倍体枇杷,其花粉败育且不能正常授粉受精,而目前对于这方面的分子机制研究甚少。生长素是促进植物生长发育的内源激素之一,参与植物生长发育的各个阶段,尤其在植物花发育和种子发育等生殖相关的过程中扮演重要角色。生长素响应因子（ARF）在生长素信号传导中具有重要作用,ARFs基因所编码的蛋白质可与生长素响应基因启动子中特定的响应元件结合,从而调节植物的各个生长发育过程。因此,本文针对三倍体枇杷ARF基因进行花发育相关的分子机制研究,这对于三倍体枇杷有性生殖及后续进一步应用具有极其重要意义。为此,本研究以“龙泉1号”二倍体（B2）及其三倍体（B355）株系为研究对象,在原位萌发观察B355杂交授粉后的细胞学行为及转录组测序的基础上,从枇杷中克隆得到育性相关的ARF基因;利用生物信息学分析该基因编码蛋白的生物学特性;利用q RT-PCR分析该基因在二倍体以及三倍体枇杷中的时空表达特性;构建含有绿色荧光蛋白的瞬时表达载体进行亚细胞定位;构建含有超表达目标基因的植物表达载体,转化拟南芥并观察表型,分析EjARF6和EjARF8基因对育性的调控功能。主要研究结果如下:1、EjARF8-like1、EjARF8-like2和EjARF6的生物信息学分析在二倍体和三倍体枇杷花的转录组测序和数字表达谱分析的基础上,从枇杷中克隆三个基因并获得基因全长,命名为EjARF8-like1、EjARF8-like2和EjARF6。EjARF8-like1基因全长2424 bp,包含一个2178 bp的ORF,编码725个氨基酸残基,推测分子量80.49 k D,等电点6.29。EjARF8-like2基因全长2633 bp,包含一个2370 bp的ORF,编码789个氨基酸残基,推测分子量88.01 k D,等电点5.98。EjARF6基因全长2899 bp,包含一个2694 bp的ORF,编码897个氨基酸残基,推测分子量99.34 k D,等电点6.16。根据同源序列比较和进化树分析显示,EjARF8-like1和EjARF8-like2基因与苹果和梨中的ARF8基因的亲缘关系最近。EjARF6系统进化树分析发现与山荆子、梨中的ARF6基因的亲缘关系较近。2、EjARF8-like1、EjARF8-like2和EjARF6基因编码蛋白生物信息学分析通过生物信息学分析对EjARF8-like1、EjARF8-like2和EjARF6基因编码的蛋白进行二级结构和三级结构预测、跨膜区域分析和亚细胞定位分析,结果显示该蛋白无跨膜结构域;推测EjARF8-like1、EjARF8-like2和EjARF6蛋白均具有保守的B3结构域和Auxin＿resp的保守结构域。EjARF8-like1和EjARF8-like2两蛋白的三级结构与拟南芥生长素响应因子At ARF1相似度极高。EjARF6蛋白三级结构与拟南芥生长素响应因子At ARF5相似度极高。3、EjARF8-like1、EjARF8-like2和EjARF6基因时空表达特性通过q RT-PCR技术研究了EjARF8-like1、EjARF8-like2和EjARF6基因在二倍体枇杷“龙泉1号”（B2）和三倍体枇杷B355中的时空表达特性。结果显示,这三个基因在二倍体枇杷的表达量整体高于三倍体;在三倍体枇杷花授粉前该基因在现蕾期（a）、微露白期（b）、露白期（c）和即开期（d）的表达量依次递减,到了露白期三倍体的表达量比二倍体高。三个基因在枇杷幼果、叶、根、花丝、花瓣、花药、花萼、雌蕊、子房中均有表达,并且检测到在花的雌蕊中表达信号最强。这三个基因在子房和花萼中表达量大致一样,在花丝中的表达低于子房而高于花瓣,发现花药中表达量极少。在即开期用激素和抑制剂处理枇杷花蕾,二倍体枇杷花中,该基因受6-BA正诱导,BR负诱导,而对ABA、GA3、NAA等激素,以及NPA和TIBA两种抑制剂的响应不明显;在三倍体枇杷花中,该基因受ABA、GA3和6-BA正诱导,BR、NAA负诱导;NPA和TIBA也无明显变化。说明该基因的表达水平可能受多种植物激素调控,并在植物激素调控花发育过程中具有一定作用。4、EjARF8-like1、EjARF8-like2和EjARF6亚细胞定位和转录活性分析成功构建了含绿色荧光蛋白的p CAMBIA2300-35S-e GFP-EjARF8-like1、p CAMBIA2300-35S-e GFP-EjARF8-like2和p CAMBIA2300-35S-e GFP-EjARF6植物表达载体和p GBKT7转录因子活性分析的载体。亚细胞定位于细胞核,进一步通过与绿色荧光蛋白相融合,证实了EjARF6定位于细胞核。5、遗传转化及功能分析构建了pLGN-35S-EjARF8-like1、pLGN-35S-EjARF8-like2和pLGN-35S-EjARF6植物表达载体并转化拟南芥,转基因拟南芥表型如下:EjARF8-like1转基因拟南芥整体长势较野生型好;叶片面积比野生型大;抽薹比野生型早;花发育畸形,尤其部分植株的雄蕊比柱头短很多,雄蕊裂开且花粉量极少,雄蕊数量与野生型有明显差异;经I2-KI花粉染色推断花粉育性差,结荚率极低,种子数目显著减少。EjARF8-like1和EjARF8-like2转基因拟南芥下胚轴长度较野生型短;幼苗根的长度明显比野生型长,侧根数目比野生型多。而EjARF6转基因拟南芥下胚轴长度和根的长度均显著比野生型长,侧根数目比野生型多。这些结果表明EjARF8-like1、EjARF8-like2和EjARF6基因具有促进植株生长,促进根生长和侧根发生的作用;EjARF8-like1基因参与花发育的调控。根据该基因转基因拟南芥表型,可以推测其参与枇杷花粉发育过程并实现育性调控功能。