论文部分内容阅读
城市污水经二级处理后,水质虽然已经改善,但细菌的绝对数量仍很可观,并存在有各种肠道病原菌。而沙门菌是其中最典型的肠道病原菌之一,沙门菌对人类可产生多种危害,诸如伤寒、急性肠胃炎、菌血症和败血症等。最常见的是胃肠炎,表现畏寒、发热,伴有头痛、头晕、恶心、呕吐、腹痛,腹泻等症状。严重者脱水和电解质紊乱。鉴于此,在城市污水再生回用中对这种病原菌进行检测以了解它的存在情况,对于以后改善污水处理工艺去除病原菌的效果以及评价病原菌带来的风险等都具有实际指导意义。本研究选用膜吸附—洗脱法对城市二级处理水进行样品前处理,并考察了滤膜材质、滤膜孔径、以及洗脱剂种类等因素对水中沙门菌回收率的影响,最终确定了最佳的膜吸附-洗脱法。通过选用一对涵盖性和特异性均较强的引物139和141,对浓缩后的沙门菌进行PCR检测。利用正交试验设计的方法,对沙门菌PCR反应体系进行5因素4水平的实验,建立了沙门菌PCR反应的最佳体系。通过梯度PCR考察了退火温度对检测结果的影响。研究还在定性PCR检测方法的基础上建立了沙门菌的定量PCR检测方法,分别采用了重组质粒和标准菌株基因组DNA作为标准模板来建立标准曲线,并比较了两种方法的优劣。另外,本次研究利用建立起来的PCR方法对二级处理水进行了连续监测,并对水中沙门菌的分布情况及其与相关影响因子的关系进行了简单分析。本次研究得到的结论如下：(1)醋酸纤维素酯微孔滤膜对沙门菌的浓缩效果比硝酸纤维素酯滤膜、混合纤维素酯滤膜和尼龙膜的效果都要好,0.22μm孔径的滤膜比0.45μm孔径的滤膜能更好的截留住细菌。采用3%牛肉膏溶液作为洗脱剂效果良好,而作为病毒优良洗脱剂的甘氨酸缓冲液在洗脱细菌时效果并不好。(2)优化最终确定的PCR反应体系为：总反应体积25μL,0.5μL模板,上下游引物浓度各为0.4μmol/L,1U Taq酶,800μmmol/L dNTPs, 2.5mmol/L Mg2+。最终选定65℃为沙门菌的退火温度。沙门菌PCR检测体系的灵敏度可达0.314ng／L,包含膜吸附-洗脱浓缩法在内的整个检测流程的灵敏度为2.13 CFU/mL水样。与传统MPN法的比较表明,该法在检测效果和检测效率上都优于MPN法。(3)相比基因组DNA,以重组质粒其作为标准品得到的标准曲线相关系数能达到三个9且线性关系良好。定量PCR检测灵敏度为15.6GEC/μL,特异性良好。样品CT值的批内变异系数小于1%,批间变异系数小于3%,精密度较高。(4)二级处理水中沙门菌PCR检测有很高的阳性率,浓度也比较高,平均值达到了3.57×104GEC/L,但是对时间的变化没有明显的规律性,这也可能和样品数量较少有关。从监测结果来看,沙门菌与粪大肠杆菌和粪链球菌这两个细菌学指标不存在相关性,与pH和浊度的相关性也不显著,而与水温成显著的正相关关系(p=0.049<0.05),相关性系数为0.650,这也与监测到的沙门菌浓度随季节转暖而增大这一趋势一致。