AhNCED1基因反义RNA载体构建及转化花生的研究

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花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的油料作物和经济作物。由于栽培花生资源种缺少一些重要病虫害的抗源,而野生花生资源抗性受种间杂交不亲和性以及与不良性状连锁等因素影响而难以利用,使常规抗性育种受到了限制。 降雨量少或季节性干旱是影响花生产量和品质的主要制约因素之一。脱落酸(ABA)作为一种胁迫信号转导物质,在植物对水分胁迫的适应性反应中起着重要作用。在生物和非生物胁迫条件下,植物体内的ABA含量增加,这种效应主要是通过激活ABA合成及抑制其降解来实现。9—顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是调节ABA生物合成的关键限速酶。 本论文以花生粤油7号6—8d苗龄的幼叶为外植体,研究了不同生长调节物(6—BA、NAA)、AgNO3和Gln对花生幼叶不定芽的诱导的影响,同时研究了不同激素配比对花生不定芽的伸长和生根的作用,优化了植株再生体系。构建了AhNCDE1基因的反义RNA载体,将其转化花生耐旱品种粤油7号,旨在通过检测转基因植株中AhNCDE1基因表达、ABA水平和抗旱性效果,以探讨花生AhNCDE1基因功能。另外,以粤油7号带胚子叶为外植体,从预培养时间、菌液浓度、侵染时间和共培养时间等因子优化了农杆菌介导的AhNCED1基因反义RNA载体转化花生的遗传转化体系。主要获得了以下结果: 1、以花生幼叶为外植体,在MS+0.6mg/L NAA+8mg/L6—BA+1mg/LAgNO3+3mg/L Gln的培养基上诱导不定芽效果最好,不定芽再生率达81.03%,每个外植体平均出芽数达5.79个。在最佳伸长培养基(MS+2mg/L6—BA+4mg/LGA)上,芽的平均伸长长度达1.0-2.0 cm。试管苗在培养基1/2 MS+0.5mg/L NAA+3mg/L IBA上的生根效果最为理想,生根率达86.15%,长出的根粗长,多侧根。再生植株经炼苗,移栽成活率达90%以上。 2、构建了带有35S启动子、以GUS为报告基因、NPTⅡ基因为抗性筛选基因的AhNCED1基因的反义RNA载体,并转化农杆菌GV3101。 3、GV3101介导的AhNCED1基因反义RNA载体转化花生的研究结果表明:预培养0d的外植体经菌液浓度OD600为0.8的农杆菌GV3101侵染5—10min后,共培养3d时GUS表达率为81.25%。本实验将侵染过的外植体在除菌培养基上经过5—7d的恢复培养后,进行低浓度选择压(100mg/L)的筛选培养,再逐步增加培养基中卡那霉素浓度,通过高选择压(300mg/L)的筛选培养,抗性芽诱导率达50.98%。 4、从获得的抗性植株中随机抽取26株进行PCR检测,其中8株PCR检测呈阳性,PCR阳性率达到30.77%,随机抽取28株进行GUS染色,60.71%呈阳性。
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