球孢白僵菌Beauveria bassiana (以下简称白僵菌)具有侵染力强、分布广以及流行快的特点；同时也具有易于培养,不污染环境等优势。因此,作为重要的昆虫病原真菌,白僵菌目前已广泛应用于农林业害虫生物防治。然而,在实验室培养和工业生产过程中,白僵菌也普遍存在着菌体退化问题。白僵菌菌体退化对于其发酵生产及杀虫效果有着直接的负面影响。研究表明,DNA甲基化修饰普遍存在于生物生命过程中。它通过调节基因表达使生物体在生长发育过程中产生出不同的性状。因此,揭示球孢白僵菌在培养过程中菌体退化与其DNA甲基化的关系,可以为今后进一步研究白僵菌表观遗传学以及DNA甲基化在菌体生长发育机制中的具体功能提供基础材料和科学依据,同时也将为白僵菌的规模化发酵与产业化奠定更加坚实的理论基础。本研究采用RACE技术克隆出球孢白僵菌DNA甲基转移酶编码基因Dim-2全序列,并通过生物信息学方法,对该蛋白进行了同源序列比对与系统发育树分析。同时,本研究还利用Realtime-PCR技术和HPLC技术对球孢白僵菌在生长发育过程中Dim-2基因的转录表达以及基因组DNA中5-甲基胞嘧啶的含量进行了检测,分析了球孢白僵菌生长发育过程中DNA甲基化的变化情况。序列分析表明,球孢白僵菌Dim-2基因cDNA序列全长为4021bp,编码了1142个氨基酸。其5’非翻译区(5’-UTR)与3’非翻译区(3’-UTR)分别为283个核苷酸和303个核苷酸。预测的白僵菌DIM-2编码蛋白分子量为128kD,理论等电点6.13。利用NCBI提供的蛋白保守区数据库(CDD)平台对球孢白僵菌Dim-2基因编码蛋白保守结构域进行预测。结果显示,该蛋白含有能催化合成5-甲基胞嘧啶的活性区域以及一个BAH结构域。蛋白多序列比对与进化树分析显示,球孢白僵菌Dim-2基因编码蛋白与GenBank中已登录注释的蛹虫草(Cordyceps militaris)、轮枝菌(Verticillium alboatrum)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)等11种真菌的DNA甲基转移酶具有高度同源性。包括白僵菌DIM-2编码蛋白在内的12种真菌DNA甲基转移酶氨基酸序列共聚成两个群。其中与球孢白僵菌Dim-2基因编码蛋白关系最近的蛹虫草DIM-2蛋白,二者一致性达到了63%。将本实验室保存的球孢白僵菌Bb2005单孢株点接于SDAY培养基中,25℃下每十天传代培养一次,并观察菌体生长与产孢情况。菌落形态学检测发现,在1-3代时,白僵菌Bb2005菌落呈规则的圆形,5天后开始产孢,第7天形成大量孢子；而第4代培养时,菌体开始出现不规则的扇形角变区域,且产孢变少；培养至第10代时出现菌丝生长旺盛,产孢明显减少的状态；而培养至第25代时白僵菌Bb2005已完全退化,菌丝疯长且很少产孢。利用Realtime-PCR与HPLC技术分别对第1代、第25代和复壮后的球孢白僵菌Bb2005菌株在第3、5、7、10、15天培养时的Dim-2基因转录表达量和基因组DNA的5-甲基胞嘧啶百分含量进行检测。检测发现,白僵菌Bb2005菌株不同代数与不同生长阶段,其DNA甲基转移酶的表达与DNA甲基化程度均有差异。球孢白僵菌DNA甲基化程度会随着其生长发育的变化而不断改变,并且DNA甲基化与球孢白僵菌Dim-2的表达具有一定的相关性。结果还显示,球孢白僵菌Dim-2基因的转录表达量与基因组DNA的5-甲基胞嘧啶百分含量在菌体生长过程中,均呈现两边高中间低的趋势。在菌体培养初始产孢阶段,都出现了一个低谷。这可能意味着球孢白僵菌Dim-2基因所引起的DNA甲基化与其生长发育及菌体退化之间具有内在的联系。同时,实验还表明,用柞蚕复壮能是退化后Dim-2甲基转移酶表达降低,说明复壮可能使球孢白僵菌去退化。