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皮毛颜色是毛用动物最主要的经济特性之一,而动物毛色的形成主要受黑色素含量的影响,通过研究黑色素合成相关基因的调控机制,对动物遗传育种中选育毛色丰富、高质量的毛用动物具有重要意义。近几年关于microRNA转录后水平调控靶基因mRNA的相关研究备受研究者关注,其中的相关机制也逐渐变得清晰。为研究miR-148对羊驼黑色素细胞中转录因子MITF的调控机制,本试验首先对体外培养的羊驼黑色素细胞的培养条件进行优化筛选,选择最佳的细胞接种密度和胰酶消化时间,在此基础上采用转染成熟体miR-148的方法,使miR-148在体外培养的羊驼黑色素细胞中过表达,最后利用qRT-PCR及Westem-blot技术,分别从mRNA和蛋白水平分析其靶基因mitf的相对表达量变化情况。同时为了进一步分析过表达miR-148对羊驼黑色素细胞基因表达的影响,试验采用转录组测序(RNA-seq)技术对过表达后的羊驼黑色素细胞进行无参转录组测序,分析不同样品中的差异表达基因,并对其进行KEGG、COG、KOG、GO等功能注释分析。研究结果:体外培养羊驼黑色素细胞的接种密度为5.0×105/mL时细胞的生长状态最佳;胰酶消化时间为5min时,消化所得活细胞率最高,且与消化时间为3min、8min时的活细胞率差异极显著。相对实时荧光定量结果显示:miR-148确实在羊驼黑色素细胞中过表达,是原表达水平的15倍,而mitf的mRNA表达无变化。Western-blot结果显示:过表达miR-148后MITF的蛋白表达量下降,抑制内源miR-148的表达后mitf的蛋白表达量上升。转录组测序结果显示:共获得51.42Gb的读取数据,组装后共获得333884条Unigene,48 993条Unigene的注释结果,而其中与黑色素合成相关基因216个。FPKM值计算结果显示:mirf表达不存在差异,而其中与黑色素合成相关的酪氨酸酶蛋白家族中酪氨酸蛋白酶(tyrosinase,TYR)和酪酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase related protein 2,TYRP2)表达均有降低的趋势。KEGG功能注释中发现MAPK信号通路、Ras信号通路以及cGMP-PKG信号通路中有多个差异表达基因,而此三条通路均涉及转录因子MITF的代谢,同时也发现多个与人类疾病相关的差异表达基因,猜测可能与过表达miR-148有关,可作为今后的研究内容。综上所述:(1)5.0×105/mL的接种密度最有利于羊驼黑色素细胞的生长;(2)胰酶消化5min为最适的传代消化时间;(3)miR-148可以与转录因子MITF的mRNA靶向结合,从而抑制羊驼黑色素细胞中黑色素合成相关基因的表达,导致黑色素合成受到抑制。