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背景与目的冠状动脉疾病和中风一直是全世界两个最大的死亡因素,它们的"背后推手"是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)病变。当脂质代谢紊乱,脂质斑块堵塞动脉壁时,血液流动困难导致冠状动脉粥样硬化性心脏病或中风发作。AS病因复杂,它所涉及的炎症学说、脂质代谢紊乱学说仍是现阶段研究的重点,深入研究有助于从根本上改善AS形成的病理基础,防止急性心脑血管事件的发生。因此,本研究采用动物实验和细胞实验相结合,以脂质代谢紊乱为切入点,观察细胞内两条脂质代谢途径:PPARy-LXR-ABCA1和自噬-溶酶体途径,探讨Rho/Rock信号通路与它们的相关性,并观察调脂通脉颗粒对于脂质斑块的治疗效果,阐释调脂通脉颗粒的作用机制。方法1.实验一:采用高脂饮食加球囊拉伤新西兰大白兔颈总动脉的方法复制AS模型,分为5组,分别是:正常组、假手术组、模型组、调脂通脉颗粒组和阿托伐他汀组。2个治疗组灌胃给药,其余3组以相同容量的蒸馏水灌胃。选择治疗6周、12周为观察点。分别在两个时间点,超声观察AS模型建立情况;血脂测定;H&E染色观察颈总动脉、肝脏病理形态;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、内皮素1(ET-1)、前列环素(PGI2)、血栓烷素(TXA2)水平;RT-PCR方法检测兔模型颈动脉中性胆固醇酯水解酶(nCEH)、Adipophilin mRNA表达情况。评价调脂通脉颗粒对AS病变内皮细胞标志物和胆固醇转运蛋白的影响。2.实验二:采用氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型。分为5组,分别是:正常对照组(Con)、泡沫细胞模型组(Mod)、泡沫细胞+R0CK抑制剂组(Mod+Y-27632)、调脂通脉颗粒含药血清组(TZTM)和阿托伐他汀含药血清组(Atorva)。CCK8法确定最佳给药浓度、给药时间、检测各组细胞存活率;油红0染色鉴定泡沫细胞形成情况;AnnexinV-FITC双标法检测各组细胞凋亡;分光光度法检测胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)含量,计算胆固醇酯(CE)/总胆固醇(TC)比值;免疫蛋白印迹法检测各组PPARγ、LXR、ABCA1蛋白表达水平。观察调脂通脉颗粒对巨噬细胞泡沫化的影响及可能作用机制。3.实验三:采用氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型。分为6组,分别是:正常对照组(Con)、泡沫细胞模型组(Mod)、泡沫细胞+自噬诱导剂组(Mod+Rapa)、泡沫细胞+自噬诱导剂+Y-27632组(Mod+Rapa+Y-27632)、调脂通脉颗粒含药血清组(TZTM+Rapa)和阿托伐他汀含药血清组(Atorva+Rapa)。采用免疫荧光法检测各组自噬体形成情况;免疫蛋白印迹法检测各组Beclin1、p62、LC3II、Rab7蛋白表达水平;免疫共沉淀法检测各组Beclin1、Bcl-2蛋白结合情况。探讨Rho/Rock信号通路与细胞自噬的关系及调脂通脉颗粒调控自噬的分子机制。结果1.实验一(1)与模型组比较,中药组TC水平下降(P<0.05),计算动脉粥样硬化指数(AI)发现,调脂通脉颗粒在12周时表现出了最佳降低高脂血症的效果(P<0.05)。(2)6周,H&E染色结果显示中药组和西药组的颈总动脉斑块得到了不同程度的控制,病变较轻,提示治疗有效。12周时模型组颈动脉斑块几乎布满整个管腔,形成了典型的脂质斑块。与模型组比较,中药组和西药组仅见少量脂质沉着,病变较轻。肝脏病理形态学结果显示,与模型组比较,中药组肝细胞虽有一定程度的损坏,但未见肝内炎症现象和纤维化改变。(3)血清ELISA结果:2个时间点,与假手术组比较,模型组血清ET-1、TXA2含量明显升高,eNOS、PGI2水平下降,差异显著(P<0.01)。与模型组比较,调脂通脉颗粒组和阿托伐他汀组ET-1、TXA2含量下降,eNOS、PGI2水平升高,差异显著(P<0.01)。(4)RT-PCR结果:2个时间点,与假手术组比较,模型组nCEH含量下降了20.81%和40.35%(P<0.05)。与模型组相比较,中药组nCEH的含量上升了 2.08%和5.69%(P>0.05)。阿托伐他汀组nCEH的含量上升了 20.61%和29.48%(P<0.05)。与假手术组比较,模型组颈总动脉Adipophilin表达升高了 26.94%和37.15%(P<0.05),与模型组相比,中药组Adipophilin的含量下降了 6.93%和10.28%(P>0.05),阿托伐他汀降低了 Adipophilin 的表达(P<0.05)。2.实验二(1)CCK8结果:与对照孔比较,模型组OD值显著降低(P<0.01)。调脂通脉颗粒含药血清浓度在5%时,细胞存活率在70%-80%之间。调脂通脉颗粒5%浓度含药血清在给药24h细胞存活率最显著,最终确定调脂通脉颗粒的给药浓度为5%、作用时间24h。调脂通脉颗粒对未受ox-LDL刺激的巨噬细胞无影响,提示无细胞毒性作用。作用24h后,与模型组比较,模型+抑制剂组、调脂通脉颗粒组和阿托伐他汀组(含药血清5%)的细胞存活率上升(P<0.05)。(2)油红0染色结果:80μg/ml ox-LDL诱导的巨噬细胞可见脂滴遍布视野,被染红的细胞在50%以上,符合巨噬细胞泡沫化的特征。模型+Rock抑制剂组可见遍布分散的脂滴。与模型组比较,调脂通脉颗粒组和阿托伐他汀组的脂滴较少,细胞膜内侧红色脂滴颜色浅,以分散的小脂滴为主。(3)AnnexinV-FITC双标法检测细胞凋亡结果:与模型组相比,调脂通脉颗粒组和模型+抑制剂组凋亡细胞明显减少(13.2± 1.68%和18.2±0.73%)(P<0.05),阿托伐他汀组的细胞凋亡率也减少(11.9±0.73%)(P<0.05)。(4)TC、FC、CE/TC比值结果:调脂通脉颗粒组TC含量降低,FC含量升高、CE/TC比值为38.19%(P<0.05)。在阿托伐他汀组中,TC、FC的含量和CE/TC的比值较模型组均有特别显著的差异(P<0.01)。(5)免疫蛋白印迹结果:Rho、Rock蛋白巨噬细胞中表达较少,ox-LDL诱导后,Rho、Rock蛋白水平显著增多(P<0.05)。与模型组比较,调脂通脉颗粒组和阿托伐他汀组PPARγ-LXR-ABCA1蛋白表达增加(P<0.05)。3.实验三(1)免疫荧光结果:与模型组相比,泡沫细胞+雷帕霉素组细胞间隙变大,荧光强度增加;泡沫细胞+雷帕霉素+Y-27632荧光强度明显增强,绿色颗粒增多。和模型对照组相比,调脂通脉颗粒组和阿托伐他汀组绿色荧光强度明显增强。(2)免疫蛋白印迹结果:RhoA、Rock蛋白在泡沫细胞中表达上升,调脂通脉颗粒干预后,蛋白水平下降(P<0.05)。与模型组比较,泡沫细胞+雷帕霉素组和泡沫细胞+雷帕霉素+Y-27632组Beclin1蛋白表达上升20.4%和29.1%(P<0.05);LC3II蛋白表达上升了 30.2%和 43.9%(P<0.05);p62 蛋白表达下降了 31.7%和 47.3%(P<0.05);Rab7水平升高了 10.0%和15.7%(P<0.05)。与泡沫细胞+雷帕霉素组比较,调脂通脉颗粒组和阿托伐他汀组Beclin1蛋白含量上升19.8%和23.4%(P<0.05);LC3II蛋白表达上升了 29.8%和 35.5%(P<0.05);p62 含量下降了 41.9%和 36.8%(P<0.05);Rab7 蛋白水平升高了34.9%(P>0.05)和 16.4%(P<0.05)。(3)免疫共沉淀结果:与正常组比较,模型组beclin1和bcl-2结合程度明显增加(P<0.05)。与模型组比较,泡沫细胞+雷帕霉素组、泡沫细胞+雷帕霉素+Y-27632组蛋白结合程度明显降低(P<0.05)。与泡沫细胞+雷帕霉素组比较,调脂通脉颗粒组蛋白结合程度也降低(P>0.05),阿托伐他汀组使两种蛋白结合程度降低(P<0.05)。结论1.调脂通脉颗粒通过调节内皮细胞标志物ET-1、eNOS、PGI2、TXA2水平,修复兔动脉粥样硬化模型内皮细胞损伤,调节胆固醇转运途径的相关蛋白,改善AS斑块。2.抑制剂Y-27632能够抑制Rho/Rock信号通路,减少自噬起始时bcl-2和beclin1的蛋白结合,增加细胞内自噬体活性,促进自噬发生,从而减少泡沫细胞形成。3.调脂通脉颗粒可能通过调节PPAR γ-LXR-ABCA1、抑制Rho/Rock信号通路,从而增加自噬-溶酶体系统相关蛋白的表达,促进胆固醇从泡沫细胞中流出,抑制巨噬细胞泡沫化,起到防止AS的作用。