论文部分内容阅读
在微生物的基因工程育种中，使用强启动子和稳定子表达目的基因，可以获得高水平的表达效果。本文选择噬菌体Φ29的A1启动子和枯草芽孢杆菌aprE基因的稳定子，构成一个新的表达盒，用于在枯草芽孢杆菌DB104染色体上替换lipA基因原有的表达元件。本文主要对lipA基因表达元件原位修饰的基因操作方法进行了研究。
采用重叠PCR方法，将两个lipA基因同源片段和红霉素抗性基因片段拼接，得到重组片段LE：LE与质粒pEASY-T1载体连接，在大肠杆菌中构建了重组质粒pT1-LE；转化枯草芽孢杆菌DB104，筛选得到了具有红霉素抗性的lipA基因缺陷菌株DB104E。构建了带有野生型lipA基因片段的重组质粒pT1-LA，用于转化DB104E，可以恢复lipA基因的缺陷；并发现lipA+菌株可以在橄榄油基本培养基上生长，而lipA-菌株则不能生长，橄榄油基本培养基能够用于筛选lipA+的转化子。通过重叠PCR方法，将A1启动子序列、aprE稳定子序列和上下游lipA基因同源序列拼接，得到了重组片段LPAS，与质粒pEASY-T1 Simple连接，在大肠杆菌中构建了重组质粒pT1-PAs；通过对质粒pT1-PAs的测序，证明A1启动子序列和aprE稳定子序列按照预定设计拼接成一个表达盒；但质粒pT1-PAs转化DB104E，在橄榄油基本培养基上不能筛选出转化子，推测因为可能是表达盒没有功能，或者转化方法存在问题。为了证明在pT1-PAs转化过程中基因重组确实发生，采用酶切连接的方法，将氯霉素抗性基因插入到pT1-PAs中A1启动子与上游同源片段之间的EcoRI位点上；连接产物转化大肠杆菌，检测了将近70个菌落，结果都是假阳性菌，没有得到转化子的因为是重组质粒缺少筛选标记且连接体系不合适。另外，因为特定序列限制了PCR引物的设计，将上下游同源序列、氯霉素抗性基因序列和表达盒序列拼接为重组片段的重叠PCR也没有成功。但是，根据本研究所获得的经验，用这种方法在染色体原位修饰lipA基因的表达元件是可行的。