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利用增强型绿色荧光蛋白EGFP基因作为报告基因对巴西固氮螺菌Yu62进行标记。首先将质粒pEGFP-C1中EGFP基因克隆至原核表达载体pVK-100上,构建重组质粒pVK-EGFP,此质粒中含有固氮螺菌复制子,可在巴西固氮螺菌Yu62中稳定复制。然后利用电转化法将重组质粒pVK-EGFP转入巴西固氮螺菌Yu62中,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对绿色荧光蛋白表达情况进行检测,结果表明EGFP基因在巴西固氮螺菌Yu62中能稳定表达,获得EGFP标记的菌株。在限菌条件下,用标记菌株侵染小麦(小偃107)露白种子,取接菌1、3、5、7、30天后的小麦幼苗,经75%乙醇和1%次氯酸钠表面消毒后置于含四环素的YMA培养基上贴板培养,进行固氮菌的分离以及固氮菌在小麦中的初步定位。培养48小时后于波长为365nm紫外灯观测,结果表明,随着接菌时间的推移,小麦发荧光部位由根尖生长点逐步向上蔓延,直至茎部和叶部。另取接菌相同天数的小麦制作切片,用荧光显微镜观测固氮菌在小麦内的定殖规律。结果显示,在接菌后的第1天,标记菌株主要定殖根表面。在接菌后的第3天,标记菌株进入到小麦根的皮层,主要位于细胞间隙。在接菌后的第5天,标记菌进入内皮层,少数菌株进入到维管束。在接菌后的第7天,大量菌株进入到维管束,导管内有少量标记菌的侵入。在接菌后的第30天发现在茎、叶中有标记菌定殖,结果表明固氮菌可以由根部向地上部位迁移。在开放条件下,将挑选出籽粒饱满的小麦(小偃107)分为两组,其中一组以巴西固氮螺菌Yu62作为菌肥,与小麦(小偃107)作拌种试验,拌种方法为:将培养至OD值约为0.6的巴西固氮螺菌菌液浸泡小麦种子,浸泡时间为2h,浸泡后将接菌小麦和不做任何处理的对照小麦种于田间,种植时沟宽0.2m,每行小麦均匀种植,保证接菌小麦和对照在数量上基本一致。在接菌五个月后对小麦观测,结果表明接菌小麦在株高以及叶片颜色上比对照小麦更高、更绿。在接菌七个月后对小麦观测,结果表明接菌小麦在株高、分蘖数以及根系发达程度上比对照小麦都有较大优势。从中可以得到以下结论:巴西固氮螺菌作为禾本科植物内生固氮菌对植物有明显的促生作用。