缺血缺氧性脑病是严重影响人类健康的重大疾病之一,严重影响生活质量。目前尚无一种神经保护剂在III期临床实验中被证实有显著疗效。缺血缺氧性脑病的发病机制主要有:能量衰竭,一氧化氮（nitric oxide, NO）损伤、酸中毒、兴奋性氨基酸的毒性、自由基的损伤、钙超载等。临床实践中所采用的治疗措施以及保护剂的研发也主要围绕这几个方面进行,如钙离子拮抗剂、兴奋性氨基酸拮抗剂、自由基清除剂等,但疗效不甚理想。回顾机体的氧利用研究,以往先后发现血红蛋白（Haemoglobin, HGB）、肌红蛋白（Myoglobin, MGB）在机体的氧转运、储存和利用过程中发挥了重要作用。然而大脑的情况却有所不同。尽管人脑仅占体重2%,但即使在安静状态时其耗氧量也约占人体总耗氧量的20%以上。如此之高的氧利用率在神经系统内是如何完成的呢?长期以来这是一个谜。直至2000年克隆出脑红蛋白（Neuroglobin, NGB）编码基因才提供了这方面的线索,为回答长期以来困扰人们的“脑内氧是如何被利用”的问题提供了启示。NGB与HGB、MGB同属于携氧珠蛋白家族,但氨基酸序列相似性仅在20²5%左右。NGB在生化性质上类似于血红蛋白和肌红蛋白,能够可逆地结合氧,其结合氧的能力高于血红蛋白,接近于肌红蛋白。这样,即使在血氧浓度较低时,与氧具有很高亲和力的NGB将十分有利于转运氧通过血脑屏障,可提高高耗氧的脑组织中氧的利用率。在缺血缺氧等病理条件下NGB的表达被上调。已证明通过转染NGB质粒或NGB腺病毒载体到细胞或脑组织内,使其过表达NGB,能够保护神经元免受缺氧损伤。然而,脑红蛋白是怎样保护神经元免受缺氧性损伤的,即脑红蛋白神经保护的作用机理如何?这一问题却一直未得到有效回答。本文从多方面对NGB的功能及神经保护机制进行了初步研究。首先,成功构建了NGB的RNA干涉载体,通过RNA干涉技术封闭了PC12细胞中内源性的NGB,然后用氯化钴（cobalt chloride, CoCl₂）诱导缺氧损伤,结果发现,干涉内源性NGB表达后PC12细胞存活率显著降低。随后我们又在成功构建NGB真核表达载体pCMV-myc-NGB的基础上,通过基因转染使PC12细胞过表达NGB,用抗特异性标签Myc的单克隆抗体检测到目的基因NGB表达,通过用CoCl₂诱导缺氧使过表达NGB的细胞发生损伤,结果发现过表达NGB可明显减轻CoCl₂诱导的PC12细胞损伤。这些结果提示细胞内源性NGB和过表达NGB均具有抗缺氧损伤的作用。NGB神经保护功能的明确为NGB神经保护机制的研究奠定了基础。NGB作为携氧珠蛋白家族中的一员具有NO的功能。在利用NO供体硝普钠（sodium nitroprusside, SNP）进行的研究中我们发现,PC12细胞过表达NGB可明显减轻SNP诱导的PC12细胞损伤。而随后对其机制的研究发现,NGB并未改变PC12细胞内NO含量,但是RT-PCR检测结果发现,抗凋亡基因bcl-2的表达在NGB过表达后明显上升。已知NO可通过开放线粒体膜通透性转换孔（permeability transition pore, PTP）,释放细胞色素C,激活Caspase级联反应,下调bcl-2基因表达导致细胞凋亡。由此提示,过表达NGB抗NO损伤的机制之一可能是作用于NO所致细胞凋亡通路中的部分环节,使bcl-2基因表达上调从而实现神经保护功能。能量衰竭在缺血缺氧性脑损伤中的发病机制中占重要地位。在本实验室前期工作中通过酵母双杂交技术获得了与NGB相互作用的蛋白质Na⁺, K⁺-ATPase 1β2（Na⁺, K⁺-ATPase beta-2 subunit, ATP1b2）亚基,并通过GST pull down、免疫共沉淀等实验验证了NGB与ATP1b2亚基的相互作用。Na⁺, K⁺-ATPase是脑组织中高耗能的一个酶,生理状态下就利用了脑组织中产生的ATP的40⁵0%,对其活性的适度抑制,可能会通过能量保存机制一定程度上缓解细胞损伤。由于β亚基是Na⁺, K⁺-ATPase的调节亚基,我们推测与其发生相互作用的NGB蛋白会对Na⁺, K⁺-ATPase活性发生影响。随后研究发现,原核表达的NGB与对照蛋白GST相比能够明显抑制出生3天大鼠脑组织中Na⁺, K⁺-ATPase的活性。而在细胞内过表达NGB同样可抑制NG108-15细胞内源性的Na⁺, K⁺-ATPase活性,且这种抑制具有剂量和时间依赖性。为了进一步证明NGB可能是通过适度抑制Na⁺, K⁺-ATPase活性发挥神经保护作用,我们用Na⁺, K⁺-ATPase抑制剂——乌本苷（ouabain）与PC12细胞孵育,通过对细胞Na⁺, K⁺-ATPase活性的检测发现随乌本苷浓度的增加,PC12中细胞Na⁺, K⁺-ATPase活性明显减低,而在抑制Na⁺, K⁺-ATPase活性后加入CoCl₂诱导PC12细胞损伤,PC12细胞的活性与未加乌本苷组相比明显增强。以上结果提示NGB的另一神经保护机制可能是通过适度抑制Na⁺, K⁺-ATPase活性实现。在揭示NGB神经保护机制的同时,为了使NGB能更快地投入临床研究,我们在通过生物工程技术制备大量可溶性人源NGB重组蛋白（recombinant human neuroglobin, rhNGB）的基础上,对rhNGB的功能也进行了探讨。结果发现,一定浓度的rhNGB蛋白可减轻CoCl₂所致的PC12缺氧细胞损伤。随后用报告基因碱性磷酸酶4型（alkaline phosphatase 4, AP4）对NGB的功能研究发现,AP4-NGB能与原代培养的大鼠乳鼠神经元表面发生结合,提示神经元表面可能存在与NGB结合的特异性位点。为此我们制备了PC12细胞的膜蛋白,为后续通过免疫沉淀结合质谱鉴定神经元表面的NGB结合蛋白奠定了基础。综上所述,本文对脑红蛋白的细胞保护功能和神经保护机制进行了一系列研究,发现内源性NGB和通过基因转染过表达NGB均具有神经保护功能;证明NGB可能是通过抗NO损伤途径发挥神经保护作用,其机制可能与NGB上调抗凋亡相关基因bcl-2的表达有关;证明NGB可通过与ATP1b2亚基的相互作用,一定程度地抑制Na⁺, K⁺-ATPase的活性,在缺氧早期,减少细胞的能耗,降低细胞对氧的需求,发挥神经保护作用;证明rhNGB蛋白具有神经保护作用;而且NGB蛋白能与原代培养的大鼠乳鼠神经元表面发生结合。这些结果为NGB功能的进一步揭示和临床应用提供了理论依据。