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研究背景小胶质细胞（Microglial cells,MGCs）具有维持组织稳定的功能;在中枢神经系统疾病和视网膜退行性变（如青光眼、糖尿病眼病和老年黄斑变性）,最新的研究结果证明了活化的小胶质细胞参与了疾病的进展。作为中枢神经系统和视网膜的免疫细胞,视网膜小胶质细胞对视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa,RP）的作用目前仍不清楚。在本次研究中,我们将探讨视网膜小胶质细胞在视网膜色素变性发生发展中的作用,为视网膜色素变性的预防和诊治提供新的策略。研究目的1.探究视网膜小胶质细胞在由不同基因突变造成的视网膜色素变性模型中的密度、分布和激活状态。2.在利用Cre-LoxP-STOP系统建立的新的视网膜色素变性小鼠模型种,探究视网膜小胶质细胞在病程进展中的密度、分布和激活状态随时间变化的情况。3.使用Cre-LoxP-STOP系统在视网膜色素变性的早、中、晚期进行基因治疗,以探究基因治疗对疾病病程的影响,以及对视网膜小胶质细胞的密度、分布和激活状况的改变。研究方法和结果在第一部分实验中,我们使用了Pde6αD670G/D670G和Pde6βH620Q/H620Q两种小鼠模型。这两种小鼠模型的基因突变位点与两位视网膜色素变性患者的基因突变的位点造成的的氨基酸改变一致,都分别位于PDE6（3’,5’-cyclic-nucleotide phosphodiesterase,环核苷酸磷酸二酯酶）的α和β亚基的催化基团上。依据PDE6在人和小鼠种属间的同源性,我们预测,两种小鼠模型的致病原理与两位患者的致病原理相似,故该小鼠模型最大程度的模拟了视网膜色素变性患者的疾病状态。之后,我们将该两种小鼠模型与可以特异性的在小胶质细胞中高表达绿色荧光蛋白（GFP）的Cx3cr1GFP/+小鼠模型杂交,以便更好的观察在小鼠视网膜色素变性时,视网膜小胶质细胞的形态改变及其在视网膜各层中分布的改变。在我们获得的Cx3cr1GFP/+Pde6αD670G/D670G和Cx3cr1GFP/+Pde6βH620Q/H620Q两种视网膜色素变性模型中,视网膜感光细胞层厚度在4周时有不同程度的降低,而视网膜小胶质细胞均呈现密度增加的现象。且在疾病模型中,视网膜小胶质细胞活化,细胞体增大呈气球样。另外,在对照小鼠中,视网膜小胶质细胞分布于外丛状层和内层神经层;而在疾病模型中,视网膜小胶质细胞分布于视网膜全层,尤其是细胞凋亡严重的区域:视网膜外核层和内、外节盘膜层。在第二部分实验中,我们引入了Pde6βSTOP/STOP小鼠模型,并利用Cre-LoxP-STOP体系,建立一个可以进行基因治疗的疾病模型,其基因型为Cx3cr1GFP/+Pde6γCre/+Pde6βH620Q/STOP。在该小鼠模型中,感光细胞层厚度随时间变化逐渐减低,且感光细胞对光刺激的反应逐渐减小。而在整个疾病进程的中期,视网膜小胶质细胞的密度呈现稳定的平台期,持续并稳定的维持在高于对照小鼠模型的水平;直至疾病晚期,感光细胞的大量死亡之后,活化的视网膜小胶质细胞的密度逐渐降低。且类似的,在该模型中,视网膜小胶质细胞的细胞体增大呈气球样,并分布于全层视网膜,尤其是外核层和内、外节盘膜层,即细胞凋亡发生的区域。此部分实验为后续的基因治疗之后,观察小胶质细胞的形态变化及在视网膜中的分布的变化提供了背景基础。在第三部分实验中,通过在早、中、晚期三个时间点对Cx3cr1GFP/+Pde6γCre/+Pde6βH620Q/STOP小鼠模型进行基因治疗。我们发现在三个治疗时间点治疗后2周,视网膜色素变性的病程均停滞,并可以在很长时间内维持稳定;并且越早治疗,对视网膜感光细胞的保护作用越好。此外,视网膜小胶质细胞不会因为治疗时间的不同而出现差异:不同的时间点进行治疗时,视网膜小胶质细胞的密度在治疗后2周依然维持在较高水平,治疗后6周内恢复至对照小鼠的密度。且视网膜小胶质细胞的分布均于治疗后4-6周逐渐局限于内外从状层和内层神经视网膜层内,并逐渐恢复至高度分枝状,呈现去激活状态。研究结论1.视网膜小胶质细胞在不同的Pde6突变小鼠模型中,均呈现活化状态,并分布于细胞凋亡的区域,比如外核层和内外节盘膜层。2.在视网膜色素变性病程中期,视网膜小胶质细胞密度高于对照并维持稳定,直至病程晚期;病程晚期时,感光细胞大量死亡之后,视网膜小胶质细胞的密度呈现下降趋势。3.利用Cre-LoxP-STOP系统对小鼠进行基因治疗,治疗后2周,视网膜色素变性的病程均停滞,并可以在很长时间内维持稳定;但视网膜小胶质细胞的密度在治疗后2周依然维持在较高水平,于治疗后6周之内恢复至对照小鼠的视网膜小胶质细胞密度,同时其分布和形态恢复至正常状态。4.利用Cre-LoxP-STOP系统在病程进展的不同时期进行基因治疗时,早期治疗的视网膜感光细胞层的厚度和感光细胞对光刺激的反应幅度的效果明显好于晚期治疗;而视网膜小胶质细胞对治疗的反应的变化情况却不会因为治疗时间的不同而出现差异。