中国野生华东葡萄泛素连接酶基因VpUIFP1调控抗病功能研究

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葡萄作为世界上分布最广、用途最多的重要经济类果树之一,被广泛栽培利用。特别是欧洲葡萄(Vitis vinifera L.)品种,因其品质优良、加工产品丰富且营养价值高,成为了葡萄生产上的主要栽培品种。但是,其最突出的问题是不抗病,尤其是不抗葡萄白粉病。中国作为葡萄的重要起源地之一,拥有极其丰富的野生葡萄种和变种。近几十年的研究发现,中国野生华东葡萄白河-35-1(Vitis pseudoreticulata W.T.Wang Baihe-35-1)株系具有高抗白粉病的特性。本研究以中国野生华东葡萄白河-35-1为材料,从课题组前期构建的白粉菌诱导的cDNA文库中筛选了F-box类型的泛素连接酶基因VpUIFP1;克隆获得基因VpUIFP1全长序列及其启动子序列;研究了基因VpUIFP1响应白粉菌的表达模式;在欧洲葡萄红地球中过量表达基因Vp UIFP1,分析其调控抗病的功能;通过酵母双杂交(Yeast two-hybrid,Y2H)筛选获得VpUIFP1的互作蛋白VpSKP1.1和VpTrxz;本研究取得以下结果:(1)通过qRT-PCR分析白粉菌诱导的中国野生华东葡萄白河-35-1 cDNA文库中基因F-box及其在欧洲葡萄红地球中的同源基因受白粉菌诱导后的表达模式,结果显示基因VpUIFP1在白河-35-1中上调表达的程度明显高于在红地球中的表达程度。(2)通过cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得泛素连接酶基因VpUIFP1的全长序列,其开放阅读框(Open readign frame,ORF)为1068 bp,编码355个氨基酸,GenBank登录号为KU160540;通过生物信息学预测分析,蛋白VpUIFP1的N端含有一个F-box保守结构域,C端含有两个Kelch motif。在亚细胞定位分析中,蛋白VpUIFP1定位于细胞质和细胞核。(3)在拟南芥和欧洲葡萄红地球中过量表达基因VpUIFP1增强了植物对白粉病的抗性。过量表达基因VpUIFP1激活了水杨酸(Salicylic acid,SA)合成的关键基因ICS2以及超敏反应(Hypersensitive response,HR)中的重要基因NPR1和PR1,促进了H2O2的积累,抑制了白粉菌的生长。(4)克隆了基因VpUIFP1启动子及其在红地球中的同源序列,经序列比对分析,白河-35-1的基因VpUIFP1启动子含有一个W-box顺式作用元件,而其欧洲葡萄红地球的同源序列在相同位置不含有W-box。将启动子序列与GUS报告基因融合,在葡萄叶片中瞬时表达,经GUS组织化学染色和GUS蛋白活性定量分析,白河-35-1的基因VpUIFP1启动子受白粉菌诱导后活性高于红地球中同源序列的活性。基因VpUIFP1启动子缺失W-box后,其受白粉菌诱导后活性降低,说明W-box是启动基因VpUIFP1响应白粉菌表达的重要顺式作用元件。(5)通过酵母双杂交技术筛选获得VpUIFP1的互作蛋白VpSKP1.1和VpTrxz,并通过Y2H和双分子荧光互补实验(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)验证了其互作关系。蛋白VpSKP1.1(GenBank登录号为KU160541)为泛素连接酶SCF复合物的重要组分,蛋白VpUIFP1与蛋白VpSKP1.1互作,说明VpUIFP1作为SCF复合物的组分而发挥泛素连接酶的功能。蛋白VpTrxz(GenBank登录号为KU160543)为z类型的硫氧还蛋白。在过量表达基因VpUIFP1的红地球葡萄叶片中,蛋白VpTrxz的丰度降低,经蛋白酶抑制剂MG132处理后,其蛋白丰度被恢复。说明蛋白VpUIFP1参与组装泛素连接酶SCF复合物,进而调控蛋白Vp Trxz经泛素/26S蛋白酶体途径降解。(6)硫氧还蛋白基因VpTrxz在受到白粉菌诱导后下调表达。葡萄叶片受白粉菌侵染时,干扰硫氧还蛋白基因Vp Trxz促进了H2O2的积累,增强了叶片对白粉菌的抗性。综上所述,中国野生华东葡萄泛素连接酶VpUIFP1通过介导硫氧还蛋白VpTrxz经泛素/26S蛋白酶体系统降解而正调控葡萄抗白粉病。
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