中国藏、汉人群UGT1A9,1A7遗传多态性的比较分析及结直肠癌候选基因3’UTR功能风险预警标志物的初步筛查

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第一部分UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGTs)作为一类重要的Ⅱ相药物代谢酶催化葡萄糖酸化反应,负责35%的Ⅱ相药物代谢。因而,UGT酶在药物代谢过程中发挥着非常重要的作用,需要我们加深对其的了解。但是UGTs的活性存在个体及种族间的差异,影响临床药物疗效及药物的安全性,而造成该差异的原因是由于基因组中大量遗传多态性位点的存在。因此,全面系统的了解UGT家族基因的遗传多态性将有助于有效的开展个体化用药,从而提高药物疗效减少毒副作用。本课题选取该家族中重要的两个基因UGT1A9.1A7作为研究对象,国内外已经对这两个基因进行了不少深入研究,但关于中国藏族人群及藏汉民族遗传信息的比较相对较少。中国是一个由56个民族组成的大民族国家,汉族是最大的一个民族人口占中国总人口的90.56%,而藏族则是中国少数民族中的一个主要民族,由于种族及地域的差别可能也会造成遗传信息的差异。该研究以藏、汉两个民族人群为研究对象,随机选取这两个民族健康志愿者各100例,对正常人群UGT1A9.1A7基因的遗传多态性做了全面系统研究。研究结果如下:1.UGT1A9中共检测到21个变异位点,其中7个是新发现的变异。三个高频变异(-1888T>G,95246T>C,96292C>T)的等位基因频率在藏汉民族间具有显著性差异。UGT1A7中检测到27个变异位点,其中三处高频变异(-561A>C,85243T>C,86289C>T)的等位基因频率在藏、汉民族间具有显著性差异。此外,功能预测结果显示,-1888G,一1819C.-441T,-57G影响了转录因子的结合。2.UGT1A9*1b,UGT1A7*3是中国人群主要的缺陷等位基因。3.单倍体型分析表明,ACTCTC是藏族人群主要的单体型,频率为52.9%;TCTCGT是汉族人群主要的单体型,频率为57%。此外,CCC是中国人群主要的一种单体型,频率约为85%。本研究中,我们系统的对藏、汉民族UGT1A9.IA7的遗传信息进行了分析,发现等位基因和基因型频率、连锁不平衡模式(Linkage disequilibrium,LD)、单体型及标签SNPs在两民族中是存在一定差异的。因此,本研究中UGT1A9.1A7藏、汉人群的遗传信息将为更多的有关药代动力学的研究奠定一定的理论基础,同时也为中国藏、汉人群开展个体化医疗提供数据来源。第二部分microRNAs (miRNAs)是一组小、非编码的RNA序列,长度大约18-22个核苷酸。miRNA通过和靶基因3’非编码区(3’Untranslated regions,3’UTR)结合,在细胞分化、细胞周期的进行、细胞应答反应及细胞凋亡等细胞过程中发挥关键性的基因表达调控作用。已有不少研究证实,位于miRNA靶位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNPs)会影响miRNA的结合及靶基因的表达。目前已经报道了miRNA靶标位点的SNPs与银屑病、阿尔茨海默病、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌等的发病风险相关。目前,虽有少量关于miRNA靶标位点的SNPs与结直肠癌发病风险的报道,但这些研究仅仅是通过病例-对照研究分析了SNPs与结直肠癌发病的风险,并未对靶基因的功能影响进行深入的研究,也未从真正意义上揭示miRNA与靶基因的调控关系。本研究借助生物信息学软件筛选了三个位于散发性结直肠癌候选基因CD86(rs17281995), APC (rs6875894), KRAS (rs7960917)3’UTR的miRNA作用靶点的SNPs,通过构建候选基因3’UTR的野生型及突变型的双荧光素报告基因表达载体分析SNPs位点对miRNA发挥调控作用的影响。针对双荧光素报告基因筛查有意义的位点,进一步研究预测的miRNA与靶基因的相互作用关系,主要通过Western Blot和实时定量PCR从不同表达水平研究]miRNA对靶基因的调控。研究结果如下:1.双荧光素酶筛选结果显示,与CD863’UTR含G等位基因的重组子共转染的miR-582-3p降低了荧光素酶的活力,而对含C等位基因的重组子的荧光素酶活力没有影响。2.Western Blot和实时定量PCR结果显示,miR-582-3p inhibitor抑制了miR-582-3p对靶基因的调控,使得CD86mRNA及蛋白的表达量均显著上升。本研究从一定意义上说明了miR-582-3p与CD86调控关系,但还需要在中国大样本的结直肠癌及疾病对照人群中进行统计关联分析,明确该位点是否也是中国散发性结直肠癌人群的一个新的功能风险预警遗传标志物。
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