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光学纯2-羟酸类手性模块是重要的精细化工中间体和医药中间体,2-羟酸对映体还是重要的手性拆分剂和手性催化剂,以2-羟酸为催化剂,可以将脂肪族和芳香族醛不对称转化为相应的手性醇。本实验在一锅法中通过氧化-还原级联反应体系将外消旋体2-羟酸转化成我们所需要的光学纯的单一构型产物。通过氧化-还原级联反应体系建立一个外消旋体去消旋化的模型,使其适用于大部分的2-羟酸。首先,通过基因工程技术构建一株具有羰基还原酶活性的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-CR。重组菌诱导表达后,经过Ni-NTA柱分离纯化,SDS-PAGE分析结果显示,得到电泳纯的羰基还原酶。对羰基还原酶酶学性质研究发现:酶促反应最适pH为5.5,在pH 7.0磷酸钾缓冲液中保存1周后,残余酶活力仍可达到80%以上。酶促反应最适温度为35℃,在35℃、40℃和45℃下的半衰期分别为26.58 h、14.05 h和1.83 h。金属离子和螯合剂对其没有明显的促进作用,但Fe3+、Cu2+、Ni2+离子和SDS使其完全失活。对该酶的底物特异性进行研究发现,该酶对各底物均具有催化活性。通过对各底物动力学参数研究可知,该酶对各底物的亲和力均较好,具有广泛的底物谱。其次,通过基因工程技术构建一株具有羰基还原酶活性和葡萄糖脱氢酶活性的共表达重组菌E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-CR-GDH,考察其对苯乙酮酸不对称催化还原反应的条件优化,在反应温度为35℃,Na2HP04-NaH2P04 缓冲液(pH 7.0、100 mM),葡萄糖:底物=1.5:1(c/c),细胞浓度20 g/L,底物浓度40 MM时,产物产率可以达到98.43%,e.e值为99.9%。通过对静息细胞使用批次稳定性研究发现,该静息细胞操作稳定性较好,使用六个批次后,产率仍可达到87.84%,e.e 值为 99.9%。最后,本文利用铜绿假单胞菌P.aeruginosa ZJB-1125和共表达重组菌E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-CR-GDH建立氧化-还原级联反应体系来拆分外消旋体2-羟酸。体系按两种菌体是否同时加入可分为串联反应和同步反应,串联反应根据氧化反应结束后是否离心又可分为两种。通过条件优化,得到串联反应的最佳反应条件是:温度30℃,缓冲液为 Na2HP04-NaH2P04(pH 7.0、100 mM),湿菌体量P.aeruginosa ZJB-1125:E.coli BL21(DE3)=5:2(50 g/L:20 g/L),外消旋体底物浓度30 mM,葡萄糖:酮酸底物=1.5:1(c/c),氧化反应结束后需进行离心,拆分外消旋扁桃酸的收率为92.20%,e.e值为99.9%;同步反应的最适反应条件是:温度为35℃,Na2HP04-NaH2PO4缓冲液(pH 7.5、100 mM),湿菌体 aerugiinosa ZJB-1125 colii BL21(DE3)=5:2(50 g/L:20 g/L),外消旋底物浓度 30 mM,葡萄糖:酮酸底物=1.5:1(c/c),拆分外消旋扁桃酸的收率为91.14%,e.e值为99.9%。本论文还研究了氧化-还原级联体系制备19种(R)-扁桃酸及其衍生物的反应时间、收率及对映体过量值,其中,产物对映体过量值(e.e)都大于99%。同时,还对一些底物在氧化-还原反应进程中外消旋体底物、中间底物酮酸和产物的变化情况进行研究。