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第一部分 内含子载体质粒的构建和扩增
目的:采用分子生物学方法,运用软件设计的可动性Ⅱ类内含子位点和引物构建变形链球菌comC基因和luxS基因内含子质粒载体,并且扩增产T7RNA酶的质粒pAR1219,为下一步转导变形链球菌、失活comC基因和luxS基因打下基础。
方法:根据软件设计结果,comC基因选取两个靶定位点设计,luxS基因选取三个分值最高的靶定位点设计,合成相应的引物,采用聚合酶链反应(PCR)的方法突变Ⅱ类内含子模板,连接产物到线性pACD4K-C质粒中,形成环状质粒。将pACD4K-C质粒转导到大肠杆菌中扩增,扩增后用双酶切电泳的方法鉴定质粒。
结果:在五种位点设计中,内含子模板突变产物电泳图均能显示三条条带,分别长350bp、300bp、100bp,主要目的片断为350bp。扩增后的pACD4K-C质粒双酶切后凝胶电泳显示350bp和7kb两条条带,且质粒稳定复制,质粒构建成功。
结论:comC基因的两种靶定插入位点设计和luxS基因的三种靶定位点设计都能够成功构建内含子载体质粒。
第二部分 内含子载体质粒转化变形链球菌失活目的基因的实验研究
目的:将两种质粒同时转导到变形链球菌,诱导内含子的表达并插入到comC基因和luxS基因的靶定位点中,分别构建comC基因和luxS基因失活株。
方法:同时转导pACD4K-C质粒和pAR1219质粒到变形链球菌中,通过氯霉素和氨苄青霉素的双重抗性筛选,获得具有双重抗性的变型链球菌。通过IPTG诱导pAR1219质粒表达T7RNA酶,后者再诱导pACD4K-C质粒内含子的表达,靶定插入到基因位点中,通过接种在卡那霉素筛选培养基上,筛选出内含子成功插入到基因组中的变型链球菌菌落,再用colony-PCR法鉴定内含子的正确靶定插入。
结果:在五种靶位点设计中,转导pACD4K-C质粒和pAR1219质粒后的变形链球菌均能筛选出抗25 ug/ml氯霉素和50 ug/ml氨苄青霉素的抗性菌,提示质粒转导成功。
IPTG诱导作用后,卡那霉素筛选BHI平板上可见按照五种位点设计构建的质粒转导的变形链球菌中均有抗卡那霉素菌落生成。colony-PCR反应确认内含子有无正确插入靶基因位点,在comC基因的两种设计中,只有68/69位点的设计有目的条带生成, luxS基因的三种设计中,只有132/133位点设计能够扩增出目的条带。
结论:运用可动性Ⅱ类内含子插入目的基因的方法可以高效地获得稳定的变形链球茵comC基因和luxS基因失活株,为进一步研究变形链球菌的生物膜信号系统提供实验基础。