薯蓣皂苷糖苷酶基因克隆的研究

来源 :大连工业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:yejing00
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薯蓣皂苷糖苷酶能够特异性的水解薯蓣皂苷上的鼠李糖基,生成低糖基薯蓣皂苷。本文主要对微生物Absidia sp.G3d产薯蓣皂苷糖苷酶的纯化和基因调取进行了研究。经研究确定了Absidia sp.G3d菌产薯蓣皂苷糖苷酶的最佳产酶液体发酵条件,诱导物的最佳比例为:穿山龙浸出液:麸皮浸出液=60:40;菌种的最佳培养时间为168h。利用DEAE-Cellulose DE52成功对薯蓣皂苷糖苷酶进行了纯化,经测得分子量约为56kDa。将纯化的薯蓣皂苷糖苷酶经电印迹转移后,测定了其N端序列:ATPADWRSQ。利用薯蓣皂苷糖苷酶的N端序列设计引物进行基因全序列的调取。首先提取出了产薯蓣皂苷糖苷酶的菌种Absidia sp.G3d的总RNA,根据薯蓣皂苷糖苷酶的N端序列设计引物,以总RNA为模板进行RT-PCR,扩增出部分基因片段并测序。再根据已扩增出的基因序列设计引物,进行3’RACE和5’RACE,分别扩增出了薯蓣皂苷糖苷酶的3’端和5’端的基因片段并测序。最后将所得到的三个基因片段进行拼接,得到薯蓣皂苷糖苷酶的基因全序列,其长度为1725bp,CDS区长度为1497bp。应用生物质谱技术,对薯蓣皂苷糖苷酶的电泳谱带进行氨基酸序列片段的测定。用质谱数据和已知序列对比,确定薯蓣皂苷糖苷酶的未知氨基酸序列片段,将该片段与已调取的薯蓣皂苷糖苷酶基因的CDS区翻译成的氨基酸序列进行比对,发现该片段与CDS区翻译成的氨基酸序列上的部分片段完全一致。因此可以证明所调取的薯蓣皂苷糖苷酶基因序列的正确性。
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