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脐血是造血干/祖细胞的一个重要来源,可用于临床移植来恢复患者的髓系造血功能。脐血采集后至进入临床应用前,需要优良的冷冻技术来保持造血干细胞的活性与特征。目前,除了传统的慢速冻存法外,玻璃化法逐渐成为一种颇具应用前景的低温保存技术,而良好的干细胞低温保存方案不仅要保证一定的细胞活率,同时要维持干细胞的增殖及分化能力。本实验室在前期的研究中筛选出联合玻璃化保护剂配方,并对脐血来源的造血干/祖细胞进行了低温保存。为了评价该玻璃化冷冻方案的效果,本文首先用台盼蓝拒染法检测冻后细胞活率,并用流式细胞术测定CD34~+细胞的百分含量,再对冻后的细胞进行短期的静态培养和长期的集落培养,综合考查冻后细胞的回收率与生物学特征。其次,由于导入过程是细胞发生损伤的主要环节,继而又对导入过程平衡时间进行了优化设计。实验方法主要采用显微摄像系统拍摄细胞照片,对导入过程不同时刻的细胞体积进行统计分析,并结合细胞活率的测定,确定适宜的导入平衡时间。结果表明:玻璃化冷冻复苏后,单个有核细胞平均回收率可达到81.5±1.7%,而传统的慢速冻存法,单个有核细胞回收率仅为74.7±2.6%,两者存在显著性差异。慢速冻存组CD34~+细胞的回收率为52.3%,略高于玻璃化冻存组49.7%,但两者无显著性差异。虽然,CD34~+细胞的回收率无显著差异。原代细胞,玻璃化冻后细胞和慢速冷冻后细胞在72小时内的生长状态良好,扩增倍数分别为2.7,2.3和1.9倍。各组细胞进行14天集落培养,均可形成典型的BFU-E,CFU-GM和CFU-GEMM集落,各实验组无显著性差异,玻璃化冻存组的集落回收率可达到90%以上。优化前导入平衡时间为等时间间隔,即每步导入之间均为90s,总时间为450s。细胞的体积皱缩到初始体积的35%以下,并无法有效恢复。细胞活率为88.1±3.0%。优化设计的平衡时间为前短后长的非等平衡时间间隔,即180s,180s,90s,90s和60s,总时间为600s。细胞的体积恢复至初始体积的63%,细胞活率为95.4+0.4%,具有显著提高。采用联合玻璃化保护剂对脐血造血干/祖细胞进行玻璃化冷冻保存,可以得到较高的细胞回收率,且成活细胞的功能性保持完好。对导入平衡时间进行优化设计,提出前长后短的非等时间间隔,有效地减少了导入过程细胞损失的情况。